氨苯胂酸和洛克沙胂为有机砷化合物[1-2]；5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠为硝基苯酚类化合物[3-4]；牛至油是从天然植物牛至中提取的挥发油，主要成分为2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚[5-6]。有机砷、硝基苯酚及牛至油的原料药和各种制剂可能对动物产品质量造成风险隐患[7-8]，超限量添加会导致动物体内兽药残留，危害人类健康，并造成环境污染[9-10]。为加强药物饲料添加剂管理，切实规范饲料生产环节和养殖环节兽药使用行为，我国农业农村部公告第2638号[11]和第250号[12]指出禁止在食品动物中使用氨苯胂酸、洛克沙胂及硝基酚钠类等促生长用兽药。因此，本试验旨在建立高效液相色谱同时测定兽药中氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚等7种化合物的方法，为相关兽药检测提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚、5-甲基-2-异丙基苯酚标准品的纯度均≥98%，购自TCI公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国Fisher公司；酒石酸泰乐菌素可溶性粉由湖南润邦生物工程有限公司生产；亚硫酸氢钠甲萘醌粉由广东博杰生物技术有限公司生产。1.2仪器设备Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），2998 PDA二极管阵列检测器（美国Waters公司），AX205型电子天平（美国Mettler Toledo公司），KQ-300E超声波清洗器（中国昆山市超声仪器有限公司）。1.3溶液制备1.3.1空白样品溶液称取空白样品1.0 g，置于50 mL量瓶中，加40%甲醇溶液20 mL，超声处理5 min，放冷，使用40%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。1.3.2混合标准溶液称取7种化合物标准品，使用40%甲醇溶液溶解并稀释制成每1 mL中各约含0.1 mg的溶液。1.3.3回收率溶液称取7种化合物标准品，分别使用40%甲醇溶液溶解并稀释制成每1 mL中各约含1 mg的溶液，作为标准储备液。称取酒石酸泰乐菌素可溶性粉、亚硫酸氢钠甲萘醌粉各1.0 g，分别置于50 mL量瓶中，精密加入氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚标准储备液各2、8、2、2、2、4、4 mL，加40%甲醇溶液20 mL，超声处理5 min，冷却，使用40%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，平行配制6份。1.3.4检测限溶液称取酒石酸泰乐菌素可溶性粉、亚硫酸氢钠甲萘醌粉各1.0 g，分别置于50 mL量瓶中，精密加入混合标准溶液1、2、4、8、16 mL，加40%甲醇溶液20 mL，超声处理5 min，冷却，使用40%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，过滤。1.4试验方法1.4.1色谱条件色谱柱为Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）。流速为1.0 mL/min。流动相A相为混合盐溶液，取四丁基溴化铵8.1 g、磷酸二氢钾1.4 g，加水1 000 mL溶解，加入1 mL甲酸；流动相B相为乙腈，流动相C相为甲醇，梯度淋洗程序见表1。检测器为二极管阵列检测器，进样量为10 μL，采集波长190~400 nm，提取波长254 nm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T001表1梯度淋洗程序时间/min流动相A/%流动相B/%流动相C/%060040106004011604004060400416004050600401.4.2样品前处理称取样品1.0 g，置于50 mL量瓶中，加入40%甲醇溶液20 mL，超声处理5 min，冷却，使用40%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm有机膜，作为样品溶液待测定。1.4.3样品检测对样品溶液色谱图中的各目标峰进行峰纯度检查，光谱图与光谱库进行匹配，若样品溶液色谱图中目标色谱峰的纯度角度均小于对应纯度阈值，确定目标色谱峰均为单一物质峰，若PDA匹配角度均小于匹配阈值，可认为是同一物质。2结果与分析2.1色谱条件优化对4种不同品牌色谱柱的分离效果进行了考察，不同品牌的色谱柱对7种化合物的分离效果存在一定差异，色谱柱耐用性见表2。本研究选择Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）进行试验。采用有机溶剂-水、有机溶剂-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液、有机溶剂-0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液等常见色谱条件进行试验，发现上述色谱条件均无法实现7种化合物良好的分离。因此，向流动相中添加了离子对试剂四丁基溴化铵以增强氨苯胂酸峰和洛克沙胂峰的保留，并向混合盐溶液中加入0.1%的甲酸以改善峰拖尾问题，采用梯度洗脱拟解决2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚出峰时间晚、7种化合物出峰不够集中的问题，最终建立了1.4.1项下的液相色谱条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T002表2色谱柱耐用性色谱柱类型两峰之间最小分离度Waters Xterra C18，4.6 mm × 150 mm，5 μm1.4Varian Pursuit5 C18，4.6 mm × 150 mm，5 μm2.7Agilent Zorbax SB C18，4.6 mm × 150 mm，5 μm2.4Agilent Zorbax SB C18，4.6 mm × 250 mm，5 μm3.62.2溶剂选择试验比较了甲醇和40%甲醇溶液对7种化合物的溶解情况，发现7种化合物在甲醇和40%甲醇溶液中振摇约1 min后均可完全溶解。但当以甲醇为溶剂时，氨苯胂酸色谱峰分叉，在上述液相色谱条件中无法对称出峰。因此，最终选择40%甲醇溶液作为溶剂。2.3方法学验证2.3.1专属性验证溶剂、空白样品溶液对应的色谱图中均不存在目标对照色谱峰，表明溶剂及空白样品溶液对上述7种化合物的检测无干扰。混合标准溶液色谱图与光谱图见图1~图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.F001图17种化合物色谱图注：1为氨苯胂酸，2为洛克沙胂，3为5-硝基愈创木酚钠，4为对硝基苯酚钠，5为邻硝基苯酚钠，6为2-甲基-5-异丙基苯酚，7为5-甲基-2-异丙基苯酚。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.F002图27种化合物光谱图由图1~图2可知，7种化合物的主成分峰与相邻峰分离良好，表明试验所用方法的专属性良好。2.3.2检测限测定结果以光谱图失真最大浓度的2倍作为方法的检测限，结果见表3。由表3可知，氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚的检测限分别为0.4、1.6、0.4、0.4、0.4、0.8、0.8 g/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T003表37种化合物检测限结果化合物氨苯胂酸洛克沙胂5-硝基愈创木酚钠对硝基苯酚钠邻硝基苯酚钠2-甲基-5-异丙基苯酚5-甲基-2-异丙基苯酚检测限0.41.60.40.40.40.80.8g/kg2.3.3酒石酸泰乐菌素可溶性粉和亚硫酸氢钠甲萘醌粉中7种化合物的回收率（见表4、表5）分别对酒石酸泰乐菌素可溶性粉和亚硫酸氢钠甲萘醌粉进行5倍检测限水平加标，计算平均回收率和相对标准偏差。由表4、表5可知，7种化合物的平均回收率在99.7%~102.9%之间，相对标准偏差在0.2%~1.0%之间，满足兽药检测中对回收率的要求，可用于兽药中7种化合物的检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T004表4酒石酸泰乐菌素可溶性粉中7种化合物回收率化合物回收率平均回收率RSD氨苯胂酸101.00101.25101.55101.52102.37102.80101.70.7洛克沙胂100.93101.41101.69102.48102.95103.02102.10.95-硝基愈创木酚钠99.8999.5899.2199.37100.6799.5499.70.5对硝基苯酚钠101.38102.11101.67101.82102.91102.87102.10.6邻硝基苯酚钠100.0799.8199.5999.85100.72101.52100.30.72-甲基-5-异丙基苯酚99.6599.4399.0298.79100.38101.4499.81.05-甲基-2-异丙基苯酚99.2099.5799.6699.81100.53101.38100.00.8%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T005表5亚硫酸氢钠甲萘醌粉中7种化合物回收率化合物回收率平均回收率RSD氨苯胂酸101.59101.82101.08101.17101.57101.22101.40.3洛克沙胂102.94102.68102.25102.98103.61102.85102.90.45-硝基愈创木酚钠102.72102.84102.13101.77102.39101.90102.30.4对硝基苯酚钠102.35102.44102.01101.86102.48101.80102.20.3邻硝基苯酚钠101.88101.62101.82101.72101.45101.56101.70.22-甲基-5-异丙基苯酚100.65100.80100.43100.65100.95100.79100.70.25-甲基-2-异丙基苯酚100.70100.3599.99100.50100.84100.61100.50.3%2.4阳性添加样品测定结果对两批添加了7种化合物的阳性样品溶液进行检测，结果见表6~表7。由表6~表7可知，7种化合物色谱峰的纯度角度均小于对应纯度阈值，确定7个色谱峰均为单一物质峰，光谱PDA匹配角度均小于对应PDA匹配阈值，可确定为检出7种化合物。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T006表6酒石酸泰乐菌素可溶性粉阳性添加样品检测结果化合物分离度纯度角度纯度阈值PDA匹配角度PDA匹配阈值氨苯胂酸—0.9052.2470.4591.500洛克沙胂6.11.0101.6100.2691.3085-硝基愈创木酚钠17.20.1611.4700.1101.253对硝基苯酚钠2.50.3842.0820.1891.508邻硝基苯酚钠6.80.4052.1230.1761.5522-甲基-5-异丙基苯酚33.99.28725.2884.49413.9335-甲基-2-异丙基苯酚2.88.74926.8593.92214.639注：“—”表示无分离度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.024.T007表7亚硫酸氢钠甲萘醌粉阳性添加样品检测结果化合物分离度纯度角度纯度阈值PDA匹配角度PDA匹配阈值氨苯胂酸—0.2521.2710.1381.115洛克沙胂6.10.9011.2080.2411.1105-硝基愈创木酚钠17.00.1101.2770.0471.142对硝基苯酚钠2.50.1291.3160.0571.147邻硝基苯酚钠6.80.1961.5120.0861.2482-甲基-5-异丙基苯酚33.80.8613.1050.4462.1735-甲基-2-异丙基苯酚2.90.9463.1360.3972.1963讨论目前，有机砷、硝基苯酚及牛至油类化合物的检测方法首选高效液相色谱法。安娅丽等[13]建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱同时测定土壤中氨苯胂酸、洛克沙胂及其降解产物的分析方法。林燕翠等[14]采用阴离子固相萃取柱净化，高效液相色谱法测定畜禽肉中复合硝基酚钠的残留。马建民等[15]采用高效液相色谱法对牛至中的2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚进行分析检测。李蕊等[16]建立了超高效液相色谱-串联质谱测定饲料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸的方法。但目前国内外均无公开的采用高效液相色谱技术同时检测以上7种化合物的文献报道，针对上述化合物的检测效率较低。氨苯胂酸和洛克沙胂为强极性化合物，在反相色谱柱上保留弱，较难分离；5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠在弱酸条件下极性降低，可增强在色谱柱上的保留[17]，但流动相中乙腈比例过高时达不到完全分离；2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚为同分异构体，流动相中甲醇比例过高时达不到完全分离[18]。在同一色谱条件下分离7种化合物的难度较单种化合物大大增加。为此，本研究采用高效液相色谱法，通过优化流动相种类、梯度洗脱程序及色谱柱得到最佳色谱条件，能够准确定位氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚峰的位置，具有专属性强、通量高的优点，可同时测定兽药中的7种化合物，实现对兽药中有机砷、硝基苯酚和牛至油类化合物的快速、准确检测，为兽药监管提供了一定参考。4结论本研究建立了高效液相色谱同时测定兽药中氨苯胂酸、洛克沙胂、5-硝基愈创木酚钠、对硝基苯酚钠、邻硝基苯酚钠、2-甲基-5-异丙基苯酚和5-甲基-2-异丙基苯酚等7种化合物的方法。经方法学验证，该方法操作简便、灵敏度高、结果准确，适用于兽药中上述7种化合物的同时快速检测。