随着我国畜牧业的快速发展，常规饲料已不足以满足畜牧业的需求，开发利用新的饲料资源迫在眉睫。构树是一种桑科构树属的木本植物，具有适应性强、抗逆性强等优点[1]。构树营养成分丰富，其粗蛋白（CP）含量高达20%~30%，粗脂肪（EE）约占3.20%~13.11%，还含有赖氨酸、亮氨酸等17种氨基酸以及多种天然活性物质[2-4]。研究表明，在日粮中添加10%~15%的构树青贮饲料可以增强奶牛的免疫力和抗氧化功能，并增加牛奶中的多不饱和脂肪酸浓度[1]。然而，构树的收获季节（6月—8月）正值雨季，如何有效贮存是当前的研究重点。青贮是植物在厌氧条件下附着的乳酸菌将可溶性碳水化合物（WSC）转化为乳酸（LA）等有机酸，降低青贮饲料pH值，抑制有害菌的滋生，从而保存青贮饲料的营养成分的加工方式[5]。因此，细菌在青贮过程中发挥重要作用[6]。青贮是保存构树饲料营养价值的有效方式[7]。但鲜构树缓冲能值高，WSC和附着乳酸菌含量低，导致构树常规青贮不易成功[8]。研究发现，乳酸菌添加剂能够显著改善构树的青贮品质[8-9]。甲酸（FA）通常用作化学添加剂，在青贮早期可以快速降低饲料pH值，抑制有害微生物的生长，提高青贮饲料品质[10]。朱旺生等[11]和Zhao等[12]研究发现，加入甲酸能够显著降低青贮饲料的pH值，降低干物质（DM）损失率，提高CP含量。但目前没有关于FA对构树青贮品质和微生物组成的影响研究。因此，本研究旨在探讨甲酸和乳酸菌对构树青贮营养品质、发酵品质和微生物多样性的影响，从而为提高构树青贮品质提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验材料为杂交构树，于2021年5月20日在贵州省长顺县贵州黔昌盛禾现代农业有限公司产业园收集，取株高1.3 m左右的全株构树（留茬20 cm左右）。复合乳酸菌和甲酸购自中科嘉亿生物工程技术有限公司，其中复合乳酸菌主要成分为植物乳杆菌（Laobacillus plantarum）和布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），活菌数≥1.0×1010 CFU/g；甲酸（分析纯）纯度≥88%。1.2试验设计将收集的整株构树人工切碎至1~2 cm，将300 g切碎的构树与每种添加剂混合均匀，手动装入聚乙烯袋（规格：25 cm × 30 cm）中，然后使用真空包装机进行真空包装。CK组不加添加剂，喷洒5 mL/kg 鲜重（FW）的蒸馏水；LAB组添加2×107 CFU/g FW复合乳酸菌；FA组喷洒5 mL/kg FW的甲酸。每个处理3个重复，所有青贮饲料在室温条件下储存60 d，对其感官评定、营养品质、发酵品质和微生物群落组成进行分析。1.3测定指标及方法1.3.1感官评定青贮饲料感官评定采用德国农业协会评分法进行评定[13]，青贮质量感官评分标准见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.T001表1青贮质量感官评分标准项目评分标准分数气味无丁酸臭味，有芳香果味或明显的面包香味14有微弱的丁酸臭味，或较强的酸味、芳香味弱10丁酸味颇重，或有刺鼻的焦煳臭或霉味4有很强的丁酸臭或氨味，或几乎无酸味2结构茎叶结构保持良好4叶子结构保持较差2茎叶结构保持较差或发现轻度霉菌或轻度污染1茎叶腐烂或污染严重0色泽与原料相似，烘干后呈淡褐色2略有变色，呈淡黄色或带褐色1变色严重，墨绿色或褐色呈黄色，呈较强的霉味0总分16~2010~155~90~4等级一级优良二级良好三级中等四级腐败1.3.2营养品质构树鲜样和青贮样品的DM、CP、WSC、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）按照《饲料分析及饲料质量检测技术》描述的方法进行测定[14]。构树鲜样的营养成分含量见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.T002表2构树鲜样的营养成分含量项目DM/%FMCP/%DMNDF/%DMADF/%DMWSC/%DM含量28.8715.6766.7039.912.071.3.3发酵品质准确称取20 g青贮样品，置于含有180 mL蒸馏水的烧杯中，玻璃棒搅拌混匀，置于4 ℃冰箱中静置24 h，过滤获得浸提液，测定青贮样品的发酵指标。其中，pH值采用上pH-3C酸度计测定；氨态氮（NH3-N）乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量采用DB15/T 1458—2018方法测定[15]。1.3.4微生物群落组成分析将构树鲜样和各青贮组的3个重复样品均匀的混合在一起。使用试剂盒提取样品中的微生物组总DNA，利用前引物（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和后引物（5'-GGACTACHVHHHTWTCTAAT-3'）获得细菌16S rRNA基因V3-V4高变异区。将提取的DNA送至北京百迈客生物科技有限公司进行测序。使用QIIME软件进行细菌属水平的分类学组成分析。1.4数据统计与分析利用Microsoft Office Excel 2007软件进行数据的前期处理，利用SPSS 22.0软件进行数据的单因素方差分析。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料感官评定的影响（见表3）由表3可知，构树加入添加剂青贮后，其感官评定得分均高于对照组。FA处理青贮饲料样品有明显酸香味，茎叶结构保存完整、质地柔软，等级评为一级优良；LAB处理青贮饲料样品有弱丁酸臭味，芳香味较弱，茎叶结构保持良好，烘干后略有变色，评定为二级尚好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.T003表3甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料感官评定的影响组别指标得分总分等级气味结构色泽对照组（CK）102113二级尚好甲酸组（FA）144220一级优良乳酸菌组（LAB）104115二级尚好2.2甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料营养品质的影响（见表4）由表4可知，与CK和LAB处理相比，添加FA显著增加了构树青贮饲料的DM含量（P0.05）。与构树鲜样相比，FA处理的DM损失最低，损失了0.35%；其次是CK和LAB处理，分别损失了10.53%和16.11%。不同添加剂处理对构树青贮饲料的CP含量影响差异不显著（P0.05）。与构树鲜样相比，青贮后的NDF、ADF和WSC含量均显著降低（P0.05）。其中LAB和FA处理的青贮饲料的NDF、ADF和WSC含量显著高于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.T004表4甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料营养品质的影响组别DM/%FMCP/%DMNDF/%DMADF/%DMWSC/%DM对照组（CK）25.83±0.44b14.98±0.7831.21±0.54b25.26±0.73b0.71±0.01b乳酸菌组（LAB）24.22±0.16b15.61±0.2237.5±0.91a33.65±1.00a1.19±0.04a甲酸组（FA）28.77±0.70a16.35±0.1540.32±1.16a35.14±1.07a1.34±0.10a注：同列数据相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.3甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料发酵品质的影响（见表5）由表5可知，与CK和LAB处理相比，添加FA处理显著降低了青贮饲料的pH值（P0.05）。添加LAB处理的NH3-N含量最低，为2.36%DM，显著低于FA处理（P0.05），其他处理间的NH3-N含量差异不显著（P0.05）。各处理之间青贮饲料LA含量差异均显著（P0.05），其中FA处理最高，CK最低。各处理之间青贮饲料AA含量差异均显著（P0.05），LAB处理最高，FA处理最低。所有处理青贮饲料均未检测到PA和BA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.T005表5甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料发酵品质的影响组别pH值NH3-N/%DMLA/%DMAA/%DMPA/%DMBA/%DM对照组（CK）5.25±0.06a2.44±0.06ab1.30±0.21c2.25±0.25b——乳酸菌组（LAB）5.55±0.01a2.36±0.07b2.20±0.03b3.83±0.04a——甲酸组（FA）4.41±0.03b2.58±0.01a4.62±0.75a1.39±0.25c——注：“—”表示未检出。2.4构树原料与构树青贮饲料中微生物（属水平）组成变化分析（见图1）由图1可知，构树原料上的主要微生物是未分类细菌和鞘氨醇单细胞菌属，有益菌（如乳球菌属）数量很低，表明构树常规青贮不易成功。和新鲜构树相比，青贮过后的未分类菌属的数量降低，有益菌（如：乳球菌属、植物乳杆菌属、迟缓乳杆菌属和联合乳杆菌属）的数量增加。其中添加FA处理的不动杆菌属和迟缓乳杆菌属数量高于CK和LAB处理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.018.F001图1构树原料与构树青贮饲料中微生物（属水平）组成的变化分析3讨论3.1甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料营养品质的影响青贮饲料原料的DM含量是青贮发酵的重要指标，新鲜原料的适宜水分含量有助于压实和实现厌氧环境，防止霉菌或酵母菌生长，同时青贮饲料中有益微生物（如乳酸菌）的生长和繁殖均需要水分[16]。本研究中，新鲜构树的DM含量为28.87%FM，与Hao等[17]的结果相似（26.60%FM）。新鲜构树中的NDF和ADF含量分别为66.70%DM和39.92%DM，远高于Zhang等[7]研究结果（28.49%DM和18.34%DM）。然而，新鲜构树的CP含量为15.67%DM，低于Cheng等[8]检测结果（21.15%DM~24.59%DM）。这是由于前人关注的是构树叶片，而本研究重点关注的是构树整株。饲草原料中的WSC含量是青贮发酵的另一个重要指标，WSC充当发酵底物。研究发现，原料中WSC含量大于5%DM是保证青贮发酵成功的关键[18]。然而，本研究中，新鲜构树（2.07%DM）的WSC含量（2.07%DM）小于5%DM。因此，需要添加青贮添加剂来提高构树发酵品质。与青贮前相比，不同处理的构树青贮饲料的DM含量均有所降低，其中FA组的DM含量显著高于CK和LAB处理，其DM损失最少。这是因为青贮中有害微生物迅速增殖会造成大量的DM损失，而FA的强酸性可以抑制有害微生物的生长，从而导致DM损失减少[19]。CP作为饲料评测的重要指标，也是家畜生产中需要的重要养分，饲料中的CP值越高，其饲用价值越高。与原料相比，只有FA处理的CP含量有所增加，在一定程度上可以提高构树青贮饲料的CP含量，与郭旭生[20]结果一致。郭旭生等[20]研究发现，在苜蓿青贮中添加甲酸可以有效抑制蛋白质的降解。NDF和ADF是青贮饲料中营养组成的一部分，其含量与家畜的消化率呈负相关。NDF和ADF含量越低，家畜的消化率越高，饲料的发酵品质越好。与青贮前相比，各组构树青贮饲料中的NDF和ADF含量均明显降低，这是由于发酵过后较低的pH值构成的酸性环境促进了细胞壁成分的分解[21]。与青贮前相比，各处理组的WSC含量均有所降低，加入FA的处理组的WSC含量显著高于其他处理组，可能是FA的强酸性使青贮料pH值迅速降低，致使青贮中一些不耐酸性乳酸菌和其他微生物的繁殖和活动受到了抑制，从而导致WSC含量较高。3.2甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料发酵品质的影响pH值是反映微生物活性和青贮发酵的重要指标。Kung等[19]研究发现，青贮饲料的pH值小于4.5可以抑制有害细菌的生长。本研究中，只有FA处理组的pH值（4.41）小于4.5，显著低于CK和LAB处理。这是因为FA自身的强酸性可以抑制有害微生物滋生。NH3-N是评定青贮饲料品质的重要指标，也是评价青贮饲料中蛋白质、氨基酸降解的重要指标。由于不良微生物的生长繁殖，将蛋白质分解成氨、硫化氢和胺类，当蛋白质降解率增大，NH3-N含量会增加。本研究中，FA处理未能有效降低NH3-N含量，其中的机理有待后续深入研究。有机酸（LA、AA、PA和BA）是发酵过程中常用的定性指标[22]。本研究中，FA处理的LA含量最高，显著高于CK和LAB处理。这是由于FA强酸性能够抑制有害微生物，使一些耐强酸的乳酸菌大量繁殖，从而降低pH值[20]。本研究中，LAB处理的AA含量最高，显著高于其他处理。这是由于LAB添加剂的有效成分之一是布氏乳杆菌，可以将LA转化成AA[23]。本研究中，所有青贮饲料中均未检测到PA和BA，与Cheng等[8]的结果一致。3.3甲酸和乳酸菌对构树青贮饲料微生物组成的影响微生物群落结构的变化是决定青贮饲料发酵质量的重要指标之一。乳酸菌在微生物群落中所占的比例直接影响青贮的品质[24]。本研究中，构树原料的主要微生物是未分类细菌、鞘氨醇单细胞菌属和其他，有益菌（乳球菌属）数量很低，与Cheng等[8]的结果一致。结合构树原料的WSC含量低等特点，说明构树常规青贮不易成功，必须添加额外的添加剂才能改善其发酵品质。和新鲜构树相比，青贮过后的有害菌的丰度降低，有益菌（如乳球菌属、植物乳杆菌属、迟缓乳杆菌属和联合乳杆菌属）的丰度增加，说明青贮发酵可以在一定程度上抑制有害菌的生长，促进有益菌的生长。本研究发现，在青贮60 d后，构树青贮饲料中存在促生乳杆菌属、迟缓乳杆菌属和联合乳杆菌属。促生乳杆菌属和迟缓乳杆菌属是异型发酵乳酸菌，而联合乳杆菌属是同型发酵乳酸菌[25-26]。本研究中，FA处理的不动杆菌属和迟缓乳杆菌属数量高于CK和LAB处理。不动杆菌可以利用AA在厌氧环境中生存，这解释了FA处理的AA含量显著低于其他处理的主要原因[27]。FA处理的迟缓乳杆菌属丰度较高，说明迟缓乳杆菌属比较耐强酸性。综上所述，FA处理通过促进有益菌（迟缓乳杆菌属和不动杆菌属）丰度、降低有害菌丰度来提高构树的发酵品质。4结论本研究表明，甲酸处理的构树青贮饲料具有较高的DM、WSC和LA含量，较低的pH值，甲酸添加剂主要通过增加构树青贮饲料中的有益菌含量、降低有害菌含量改善构树青贮品质。