自然资源的短缺问题引起了人们的广泛关注，研究人员积极寻找和开发可降解材料以替代以石油为原料的高分子材料[1-3]。目前，已经广泛应用的生物可降解塑料主要包括聚乳酸(PLA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)等[4-7]。PHA的加工性能良好，具有优异的可降解性和生物相容性，是环保型可降解高分子，在包装材料、电子元器件等领域受到日益关注[8-10]。但是，PHA在实际应用方面也存在局限性，其疏水性强、热稳定性差、加工窗口窄、成本高等缺点制约其发展[11-13]。PHA的力学强度较低，为20 MPa，制约其应用范围[14-15]。为了拓宽PHA在生物医学领域的应用范围，一方面需要对其进行增强改性，另一方面需要提高其生物活性。目前，常用的增强改性的方法是将无机物或纤维与高分子进行物理共混，从而提高高分子材料力学性能。常用于PHA增强改性的物质包括：剑麻纤维、埃洛石纳米管、β-TCP、埃洛石纳米管等[16-17]。增强高分子材料生物活性的方法主要包括在分子链上接枝活性分子或多肽类物质以及将具备生物活性的物质与高分子混合，如生物活性玻璃、脂质体、生长因子、羟基磷灰石等[18-19]。含铈硫酸钙是一种长棒状晶须类物质，能够起增强的作用，其中铈元素具有良好的促进成骨分化的能力[20-21]。目前，利用含铈硫酸钙对PHA进行增强改性和提高生物活性的报道较少。本实验采用高压盐溶液法制备了铈掺杂的半水硫酸钙(CeCSH)，以PHA为基体，采用共混方法制备了(PHA/CeCSH)复合材料，研究了CeCSH用量对复合材料流变性能、力学性能和生物学性能的影响，为PHA/CeCSH复合材料的应用提供参考。1实验部分1.1主要原料聚羟基脂肪酸酯(PHA)，食品级粉料，珠海麦得发生物科技股份有限公司；无水氯化钙(CaCl2)、无水硫酸钠(Na2SO4)、四水硫酸铈(Ce(SO4)2·4H2O)，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶，美国Gibco公司；ALP试剂盒、CCK-8，江苏凯基生物技术股份有限公司。1.2仪器与设备双螺杆挤出机，TE-2，南京科亚科技发展公司；差示扫描量热仪(DSC)，Q20，美国TA公司；X射线衍射仪(XRD)，D8 ADVANCE，德国Bruker公司；真空干燥箱，DZF-6030，上海圣科仪器设备有限公司；造粒机，SJ30-25，台州市昌达机械有限公司；毛细管流变仪，RG20，德国GOTTFERT公司。1.3样品制备1.3.1CeCSH的制备配制CaCl2和Na2SO4的水溶液，将Na2SO4溶液滴加到CaCl2溶液中，搅拌反应30 min，得到二水硫酸钙浆料；将浆料倒入高压反应釜中，120 ℃加热反应2 h，趁热过滤，并用热水和乙醇依次洗涤并干燥后得到半水硫酸钙(CSH)。在二水硫酸钙浆料时添加Ca物质的量为5%的Ce(SO4)2·4H2O，可得到CeCSH。1.3.2PHA/CeCSH复合材料的制备在共混前，将PHA在真空烘箱中充干燥，以PHA为基体，按照CeCSH质量分数为0、1%、2%、4%和8%的比例，将PHA粉末与CeCSH粉末充分混合均匀，利用双螺杆挤出机和造粒机制备PHA/CeCSH复合切片，利用微型注射机制备成测试样品条(60 mm×5 mm×2 mm)。1.4性能测试与表征XRD测试：管电压为36 kV，管电流为20 mA，扫描范围为5°~65°，扫描速率为2 (°)/min。SEM分析：将CeCSH粉末分散在乙醇中，将样品滴到铜台上，待样品完全干燥后，利用SEM观察CeCSH的形貌。流变性能测试：剪切速率范围为115~2 304 s-1，测试温度为145~160 ℃。力学性能测试：拉伸性能按GB/T 1040.1—2018进行测试，拉伸速率20 mm/min，温度20 ℃；冲击强度按GB/T 1043.1—2008进行测试。亲水性测试：将PHA/CeCSH样品放置在测试平台上，滴加2 μL超纯水，待水滴稳定后测定静态接触角。细胞毒性：将PHA/CeCSH进行紫外照射灭菌，按照0.2 g/mL的比例与DMEM培养基37 ℃条件浸提24 h，离心后取上清液加入FBS（FBS浓度为10%）。将骨髓间充质干细胞(BMSCs)细胞以2×104/孔的密度种植在培养板上，待细胞贴壁后，将培养基替换为浸提液，培养24 h、48 h后加入CCK-8孵育后用酶标仪测定在450 nm下光吸收值(A450)，计算细胞相对增殖率，进行细胞毒性评价。促成骨性能：将BMSCs细胞以5×104/孔与直径10 mm、厚度3 mm的圆片装PHA/CeCSH复合材料进行共培养，培养时间分别为7 d和14 d。在预设的时间点弃去培养液，并用PBS溶液清洗，并加入0.1%的Triton X-100 pH值=7.4的细胞裂解液将细胞完全裂解，并在冰浴中用细胞粉碎机粉碎，静置后取上清。利用ALP检测试剂盒检测不同组细胞培养后的ALP浓度，ALP活性为1 min中内生成1 μmol/L的对硝基苯酚(p-NP)的所需要的ALP浓度定义1个ALP活力单位(U)，以(μmol/L)/(min·mg)表示。2结果与讨论2.1铈掺杂对CeCSH结构的影响图1为CSH和CeCSH的XRD谱图。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F001图1CSH和CeCSH的XRD谱图Fig.1XRD patterns of CSH and CeCSH从图1可以看出，CSH的衍射峰分别对应14.75°(110)、25.71°(310)、29.76°(220)和31.91°(-114)等晶面，与标准PDF卡片结果相一致(JCPDS card:41-0024)，说明通过高压水热盐溶液法成功制备了CSH。当CSH中掺入5%的Ce4+时，XRD的衍射峰的位置没有发生改变，说明了Ce4+的加入没有改变CSH的晶型，材料性能不会改变。但是，CeCSH的衍射峰的强度逐渐下降，说明CeCSH的结晶度随着Ce4+含量的掺入而逐渐下降，有利于提高材料生物活性。图2为CSH和CeCSH的SEM照片。从图2可以看出，CSH为六棱柱状晶体，其直径约为10~20 μm，长度约为200~500 μm。CeCSH为六棱柱状晶体，直径约为2~10 μm，长度约为50~100 μm。研究表明，随着Ce的掺入，CeCSH晶体的尺寸有所减小。可能是由于Ce4+的掺入导致CSH结晶受到抑制，进而影响了晶体的生长形成，结晶度逐渐下降，与XRD的结果相一致。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F002图2CSH和CeCSH的SEM照片Fig.2SEM images of CSH and CeCSH2.2PHA/CeCSH复合材料的流变学性能图3为PHA和PHA/CeCSH复合材料熔体的流变曲线。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F003图3PHA和PHA/CeCSH复合材料熔体的流变曲线Fig.3Melt rheological curves of PHA and PHA/CeCSH composites从图3可以看出，随着剪切速率的增加，PHA和PHA/CeCSH的表观黏度均逐渐下降，说明了PHA属于切力变稀型流体。随着CeCSH含量的增加，在相同的剪切速率下PHA/CeCSH的表观黏度呈现出先减小后增加的趋势。在CeCSH含量为4%时，PHA/CeCSH的表观黏度最低。主要是由于PHA的分子链之间相互缠结导致分子间作用力较大，分子取向较为困难，在宏观上表现为表观黏度较高[22-24]。在PHA材料中掺入CeCSH时，PHA/CeCSH的表观黏度显著下降，因为CeCSH的尺寸较小，其在复合体系中起“润滑”的作用，使得PHA分子链之间的作用力减小，在相同剪切力的作用下取向变得容易，PHA/CeCSH表观黏度下降。CeCSH用量在0~4%时，随着PHA/CeCSH复合材料中CeCSH用量的增加，复合材料的表观黏度持续下降，说明了表观黏度在一定程度上与CeCSH的用量呈正相关。但是，CeCSH用量为8%时，PHA/CeCSH表观黏度呈现出增加的趋势。可能是由于CeCSH用量较多，导致PHA与CeCSH的相容性下降，CeCSH之间出现团聚，导致体系中实际起到“润滑”作用的CeCSH的量减少，使得PHA/CeCSH复合材料的表观黏度增加。CeCSH添加量为4%，测试温度对PHA/CeCSH表观黏度的影响。图4为PHA/CeCSH的表观黏度随剪切速率及温度的变化曲线。从图4可以看出，随着温度的升高，PHA/CeCSH复合材料的表观黏度逐渐下降。主要是由于随着温度的升高，分子的自由体积增加，缠结点的浓度下降，同时PHA分子的运动变得剧烈，分子之间的作用力下降[25-27]，因此在自由体积增加和分子作用力下降的双重作用下，PHA/CeCSH复合材料的表观黏度下降。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F004图4PHA/CeCSH表观黏度随剪切速率及温度的变化曲线Fig.4Change curves of apparent viscosity of PHA/CeCSH with shear rate and temperature2.3PHA/CeCSH复合材料的力学性能图5为不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的应力-应变曲线。从图5可以看出，PHA/CeCSH复合材料均经历了“屈服-细颈-断裂”的过程，说明了PHA为典型的韧性材料。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F005图5不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的应力-应变曲线Fig.5Stress-strain curves of PHA/CeCSH composites with different CeCSH content为了更好地探究CeCSH的用量对PHA拉伸性能的影响，依据应力-应变曲线，分析PHA/CeCSH复合材料的断裂强度和断裂伸长率随CeCSH用量的变化。图6为不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的断裂强度和断裂伸长率。从图6可以看出，随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH的断裂强度先增加后减小，而断裂伸长率先减小后增加。但在CeCSH用量为4%，PHA/CeCSH复合材料的断裂强度最大，断裂伸长率最小。主要有两方面原因：（1）当CeCSH的用量较少时，由于CeCSH的尺寸较小，在PHA/CeCSH复合材料的样条制备过程中，随着温度的下降CeCSH在体系中充当PHA结晶的“晶种”，使得复合材料的结晶度增加；而PHA/CeCSH复合材料断裂需要先破坏晶格，因此PHA/CeCSH复合材料的断裂所需拉力增加。（2）在拉伸过程中CeCSH能够起到吸收和传递能量的作用，避免了PHA/CeCSH复合材料因应力集中而过早断裂。但是，当CeCSH的用量增至8%时，PHA/CeCSH复合材料的断裂强度出现下降趋势，断裂伸长率出现升高趋势。因为当体系中CeCSH用量较多时，由于CeCSH比表面积较大，其在PHA的分散受到限制，容易形成尺寸较大的团聚体，团聚体一方面使“晶种”的数量减少，从而PHA/CeCSH复合材料的界定度下降，导致拉伸时所需的力减少；另一方面，团聚体的形成容易在拉伸的过程中形成应力集中点，导致PHA/CeCSH复合材料过早断裂，进而使得断裂强度下降。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F006图6不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的断裂强度和断裂伸长率Fig.6Breaking strength and elongation at break of PHA/CeCSH composites with different CeCSH content图7为不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的冲击强度。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F007图7不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的冲击强度Fig.7Impact strength of PHA/CeCSH composites with different CeCSH content从图7可以看出，随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH复合材料的冲击强度逐渐减小。主要是由于当CeCSH的添加量较少时，CeCSH充当“晶种”使得复合材料的结晶度提高，从而复合材料整体上偏刚性，因而冲击强度下降。而CeCSH用量为8%时，由于CeCSH的团聚作用导致PHA/CeCSH复合材料冲击强度下降的趋势变缓。因此，CeCSH导致PHA/CeCSH复合材料的韧性下降，CeCSH的用量与PHA/CeCSH复合材料的韧性呈现负相关性。图8为不同CeCSH用量的PHA/CeCSH复合材料的接触角。从图8可以看出，纯PHA接触角为95.6°，为弱疏水性材料，PHA作为生物活性材料时，其弱疏水性不利于其生物学应用。随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH复合材料的接触角逐渐下降。当CeCSH用量为8%时，PHA/CeCSH复合材料的接触角为73.1°，变为亲水性材料。接触角下降的原因可能是：（1）由于CeCSH具有较多的硫酸根基团，其属于亲水性基团；（2）由于CeCSH包含0.5个水分子，CeCSH能够与水分子进行反应，表现亲水性。因此，随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH复合材料的接触角逐渐下降，由疏水性转变为亲水性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F008图8不同CeCSH用量下PHA/CeCSH复合材料的接触角Fig.8Contact angles of PHA/CeCSH composites with different CeCSH content2.4PHA/CeCSH复合材料的生物学性能细胞毒性是鉴定材料是否能够作为生物材料使用的基本的检测手段之一。图9为不同材料的细胞毒性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F009图9不同材料的细胞毒性Fig.9Cytotoxicity of different materials从图9可以看出，24 h时，不同组的吸光度(OD)值与对照组相比基本无差异。48 h时，CSH、PHA和PHA/CSH与对照组相比无差异；而不同CeCSH用量的PHA/CeCSH复合材料的OD值明显高于对照组。细胞毒性的实验结果说明了材料无细胞毒性，不同CeCSH用量的PHA/CeCSH复合材料能够促进细胞的增殖。ALP活性是检测材料是否具有促进BMSCs细胞成骨分化的检测指标，ALP活性值越高代表材料能够促进BMSCs向成骨方向分化。图10为不同材料的ALP活性。从图10可以看出，在7 d时与对照组相比，不同CeCSH用量的PHA/CeCSH复合材料的ALP活性值均较高。而在14 d时，PHA和PHA/CSH组与对照组相比无明显差异，而不同CeCSH用量的PHA/CeCSH复合材料的ALP活性值则明显较高，且具有显著性差异。ALP活性检测结果表明，CeCSH增强了PHA材料的促成骨分化的性能，提高了材料的生物学活性。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.06.006.F010图10不同材料的ALP活性Fig.10ALP activity of different materials3结论（1）采用高压盐溶液法制备了CeCSH，CeCSH为典型的CSH晶型，且晶体为六棱柱状结构，晶体尺寸与CSH相比明显减小。（2）随着剪切速率和温度的增加，PHA/CeCSH表观黏度逐渐减小。随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH表观黏度先减小后增加。（3）随着CeCSH用量的增加，PHA/CeCSH复合材料的断裂强度呈现先增加后减小的趋势；断裂伸长率呈现出先减小后增加的趋势；冲击强度逐渐减小后下降趋势变缓。（4）PHA/CeCSH复合材料具有良好的细胞相容性，且能够促进BMSCs细胞向成骨细胞的分化。