抗生素不规范使用导致的细菌耐药性和抗生素残留等问题一直影响养殖业的健康发展[1]。为维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，我国已经全面禁止在饲料中添加抗生素。卵黄抗体（IgY）是家禽在特定抗原免疫后于卵黄中形成的相应特异性抗体[2]，作为抗生素替代品研究热点之一，可治疗由细菌或病毒引起的肠道疾病，具有安全、产量高、成本低、服用简便等优点，是一类具有广阔应用前景的抗生素替代品[3-5]。但IgY对胃蛋白酶非常敏感，且在pH值低于3.0的环境下会迅速失活，因此通过口服IgY方式治疗肠道病原体感染难度加大[6-7]。近年来，有研究将IgY作为芯材以适当囊材包裹，制成微球、纳米粒、脂质体等制品[8-10]，以避免IgY在胃中失活，同时IgY能够在小肠中稳定释放并发挥作用。本试验制备了抗大肠杆菌卵黄抗体及其纳米粒微球，观察其对小鼠大肠杆菌腹泻模型的预防作用，为开发抗大肠杆菌卵黄抗体纳米粒-微球制剂提供参考。1材料与方法1.1主要试剂及仪器普通肉汤培养基、吉姆萨色素、麦氏比浊管、蛋白胨购自南宁生化有限公司。光学显微镜购自尼康公司，全自动血液分析仪购自安捷伦公司。1.2供试动物及菌种昆明小鼠，体重18~20 g，购自广西医科大学实验动物中心（《实验动物生产许可证》scxk桂2014-0002）。疫苗菌种为产肠毒素大肠杆菌K88、K99、987P标准菌株，购自中国兽药监察所。腹泻模型菌株为临床腹泻仔猪病例分离鉴定的大肠杆菌菌株，血清型O131。1.3IgY及IgY纳米粒-微球的制备利用产肠毒素大肠杆菌K88、K99、987P标准菌株制备成油乳苗，对产蛋鸡进行免疫接种，收集高免蛋，通过水稀释-盐析法[11]获得IgY液（10.64 g/L）；以壳聚糖为主要囊材，通过离子交联和喷雾干燥制备壳聚糖纳米粒，粒径2.3 μm，载药量40.97%，包封率74.15%。1.4IgY对小鼠生理指标的影响健康昆明小鼠8只，经适应性饲养后，随机分为2组，每组4只，分为IgY组和对照组。IgY组经口灌喂IgY液，0.5 mL/只，连续8 d；对照组以PBS代替IgY作为空白对照。1.4.1小鼠体重、血常规及器官指数每日喂食前各组小鼠称重并记录，连续7 d，计算平均日增重。平均日增重=(试验结束时体重-试验开始时体重)/试验天数(1)小鼠尾静脉采血进行血常规检测。试验第8 d称重后，颈椎脱臼处死，取其肝脏、脾脏进行称重并记录，计算器官指数。器官指数=器官质量/体重(2)1.4.2巨噬细胞吞噬能力[12]于试验第7 d无菌腹腔注射10%蛋白胨。第8 d末次给药后3 h称量体重，进行巨噬细胞吞噬指数及吞噬百分率测定。颈椎脱臼处死，每只小白鼠腹腔注射Hank's液2 mL，轻揉小白鼠腹部数下后将腹腔清洗液吸出。将腹腔清洗液和5%鸡红细胞悬液按1∶4比例混合加入6孔板中，每个孔内放入一个盖玻片，每只小白鼠做2个重复。37 ℃孵育30 min，每隔10 min摇动1次。取出盖玻片后以生理盐水漂洗，晾干，用丙酮-甲醇溶液固定，然后进行Giemsa染色。将染色好的盖玻片粘于载玻片上，油镜下细胞计数，随机选择视野，数200个巨噬细胞，统计其中吞噬红细胞的巨噬细胞，计算巨噬细胞吞噬指数及吞噬百分率。吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/200(3)吞噬百分率=(200个细胞内吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200)×100%(4)1.5IgY及其纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌性腹泻预防效果的评价1.5.1小鼠大肠杆菌腹泻模型建立从临床仔猪腹泻病例中分离的致病性大肠杆菌经纯化培养后，通过麦氏比浊法和细菌标准曲线计数稀释至以下7个浓度：8.1×109、2.7×109、9×108、3×108、1×108、3×107、3×106 CFU/mL。选取18~20 g健康昆明小鼠24只，随机分为8组，每组3只。前7组分别腹腔注射不同浓度大肠杆菌营养肉汤培养液，为试验组，0.3 mL/只；第8组为对照组，注射营养肉汤，0.3 mL/只。注射完毕后，饲养观察记录其生活状态、发病情况、死亡情况，并对死亡小鼠进行解剖，观察记录其肠道病理形态。根据死亡情况得到最小致死浓度（MLC），作为下一步试验攻毒剂量。1.5.2预防效果评价小鼠预防试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T001表1小鼠预防试验设计序号组别药物类型给药方式1IgY预防组IgY液腹腔注射0.3 mL/只+口服0.3 mL/只2腹腔注射0.6 mL/只3口服0.6 mL/只4纳米粒-微球预防组纳米粒-微球腹腔注射0.3 mL/只+口服0.3 mL/只5腹腔注射0.6 mL/只6口服0.6 mL/只7对照组PBS（正常对照）腹腔注射0.3 mL/只+口服0.3 mL/只8（攻毒对照）腹腔注射0.3 mL/只+口服0.3 mL/只取体重18~20 g健康昆明小鼠，随机分为8组，每组6只。试验第1 d早、晚各给药1次，第2 d上午给药1次，给药6 h后攻毒。攻毒菌液浓度选择MLC。IgY液浓度为10.64 g/L；纳米粒-微球组40 mg/只，以0.6 mL PBS溶解；对照组药物及菌液使用PBS代替。1.6数据统计与分析试验数据应用Excel软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1IgY对小鼠生理指标的影响2.1.1IgY对小鼠体重、血常规及器官指数的影响（见图1、表2~表4）由表2可知，IgY组小鼠的平均日增重比对照组多0.09 g/d，增幅为11.25%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T002表2IgY对小鼠体重的影响组别初重/(g/只)末重/(g/只)平均日增重/[g/(只·d)]IgY组17.93±0.7424.14±1.480.89±0.11对照组18.09±0.4123.68±1.210.80±0.11由图1可知，试验期间，小鼠体重正常上升。试验第1、2 d，两组小鼠平均体重上升基本一致；第3 d开始，两组小鼠体重明显不同，IgY组小鼠每日平均增长体重开始超过对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.F001图1小鼠体重变化由表3可知，IgY组和对照组给药前后小鼠血常规指标差异不显著，IgY组和对照组在处理前、处理后组间差异也不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T003表3IgY对小鼠血常规的影响组别处理红细胞总数/(×1012/L)平均红细胞体积/fL血细胞比容/(L/L)平均红细胞宽度标准差/fL平均红细胞宽度变异系数/%IgY组处理前33.40±2.2874.80±5.982.28±0.32489.05±39.49197.93±5.31处理后30.90±0.9775.83±2.142.14±0.11482.43±12.64192.17±1.45对照组处理前32.53±2.2678.33±1.032.31±0.17501.20±9.77193.35±3.34处理后30.63±0.2379.17±3.492.20±0.09498.20±17.64192.25±1.81由表4可知，与对照组相比，IgY组小鼠肝脏指数提高了3.64%，脾脏指数提高了10.63%，且两组数据均差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T004表4IgY对小鼠器官指数的影响组别肝脏指数脾脏指数IgY组6.83±0.15*0.52±0.03*对照组6.59±0.100.47±0.02注：“*”表示与对照组相比差异显著（P0.05）；“**”表示与对照组相比差异极显著（P0.01）；下表同。mg/g2.1.2IgY对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，IgY组吞噬鸡红细胞巨噬细胞数和吞噬百分数显著升高（P0.05），被吞噬鸡红细胞数和吞噬指数极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T005表5IgY对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响组别吞噬鸡红细胞巨噬细胞数/个被吞噬鸡红细胞数/个吞噬百分数/%吞噬指数IgY组61.63±10.14*120.00±11.99**30.81±5.07*0.60±0.06**对照组47.63±8.9292.25±16.6823.81±4.460.46±0.082.2IgY及其纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌性腹泻的预防效果的评价2.2.1小鼠大肠杆菌腹泻模型建立采用不同浓度的大肠杆菌培养液对小鼠进行腹腔注射，试验结果见表6。由表6可知，攻毒用大肠杆菌菌株MLC为3×108 CFU/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T006表6小鼠大肠杆菌腹腔注射试验结果序号剂量/(CFU/mL)死亡率/%死亡情况18.1×109100.02.5 h内全部死亡22.7×109100.04.0 h内全部死亡39.0×108100.05.0~6.5 h内全部死亡43.0×108100.07.0~8.0 h内全部死亡51.0×10833.36.0 h左右死亡63.0×1070无死亡73.0×1060无死亡800无死亡小鼠死亡后解剖，取肠道观察，结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.F002图2小鼠肠道剖检结果由图2（a）可知，对照组小鼠肠道有弹性，色泽正常，结肠段圆润，粪便颜色土黄。由图2（b）~图2（d）可知，试验组小鼠小肠段肠道充盈水样物质，肠壁变薄，水肿充血，颜色暗红；肠腔内充满恶臭、稀薄、黄色内容物；结肠段形状不规则，粪便颜色发黑。结果表明，本试验菌株能够引起肠道黏膜受损，肿胀出血，且影响肠内容物及粪便状态，且有不同程度的腹泻症状。以此菌株建立小鼠腹泻模型，腹腔注射浓度3×108 CFU/mL的菌液0.3 mL，进行下一步试验。2.2.2预防效果评价（见表7）由表7可知，两种药物的3种给药方式均对大肠杆菌感染引起的腹泻具有一定的保护作用。从给药方式看，腹腔注射+口服给药预防效果最佳，IgY及纳米粒-微球组的死亡率分别为0和16.67%；从药物类型看，IgY组的预防效果较纳米粒-微球组好，3种给药方式的死亡率均较低，纳米粒-微球组口服给药方式死亡率较高（83.33%）。此外，纳米粒-微球组腹腔给药组在攻毒前出现4只小鼠死亡，经过剖检，肠壁及肝脏等器官表面有酪样附着物，初步分析为微球分解产物无法被完全吸收，影响了小鼠正常机能导致突然死亡。结合腹腔注射+口服给药组小鼠攻毒前也曾出现精神沉郁、被毛松乱症状，提示IgY纳米粒-微球不适宜采用腹腔给药方式，应禁止腹腔大量注射。未死亡发病小鼠主要症状为精神萎靡，倦怠，抱团，眼睛半眯无神、有分泌物，被毛松乱等，症状程度不一，36 h后存活小鼠基本好转。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.015.T007表7小鼠预防试验结果组别给药途径死亡率/%平均死亡时间/hIgY组腹腔注射+口服0（0/6）—口服16.67（1/6）14.00腹腔注射33.33（2/6）15.50纳米粒-微球组腹腔注射+口服16.67（1/6）16.00口服83.33（5/6）22.20腹腔注射0（0/2）—对照组正常对照0（0/6）—攻毒对照100.00（6/6）12.66注：纳米粒-微球组腹腔注射原试验动物数量6只，给药后攻毒前意外死亡4只，仅剩2只小鼠进行攻毒试验。3讨论3.1IgY对小鼠生理指标的影响体重和血常规在一定程度上反映机体的生长发育情况和健康状态变化[13]。IgY组小鼠的平均日增重大于正常对照组，高出0.09 g/d，增长11.25%，说明该组小鼠体重增长速度更快，IgY对小鼠的生长发育具有一定促进作用。血常规中红细胞指标变化通常提示体液丢失或贫血、溶血、营养异常等健康问题。两组小鼠对应指标检测结果无差异，说明IgY对小鼠健康无明显不良影响。脏器指数可在一定程度上反映该器官功能的强弱。在药物安全性评价体系中，脏器指数也是一种必要的检测指标，可为药物评价提供一定的参考。脾脏是机体中最大的免疫器官，脾脏指数是衡量机体免疫状态的初步指标。肝脏一定程度上也参与免疫调节。本研究中，IgY组小鼠的脾脏指数及肝脏指数均显著高于对照组，表明IgY及其代谢产物对小鼠免疫器官具有一定的促进功能。巨噬细胞是机体主动免疫的第二道防线，其细胞活性和吞噬能力是衡量机体细胞免疫水平，特别是非特异性免疫功能的一个重要标志[14]。本试验中，IgY组小鼠巨噬细胞的吞噬百分数和吞噬指数均高于PBS对照组，说明表明IgY对小鼠巨噬细胞吞噬活性和能力具有一定的促进作用，利于病原菌等异物的清除。这与姚营[15]的研究结果一致，也与本试验中IgY组脏器指数显著增高相互佐证。综上所述，在疾病防控方面，IgY不仅能够与相应抗原特异性结合，其对机体的生长发育尤其是免疫系统也具有一定的正向调节和促进作用，帮助机体抵抗病原的入侵。3.2IgY及其纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌性腹泻的预防效果评价本研究进行了抗大肠杆菌IgY与IgY纳米粒-微球对小鼠大肠杆菌腹泻的预防试验。结果显示，二者对大肠杆菌感染引起的小鼠腹泻均具有一定的保护作用。在预防试验中，3种给药方式（腹腔注射+口服、腹腔注射、口服）以腹腔注射+口服为最优，两种药物中（IgY及IgY纳米粒-微球）以IgY效果更好。本试验的攻毒方式为腹腔注射，细菌主要作用部位为腹腔内，与自然感染途径（经口感染）的主要作用部位（肠道）有一定区别，故在抗体与抗原结合时，作用部位（腹腔）的IgY浓度越高，对病原菌的中和能力越强，效果也越好。IgY纳米粒-微球的设计目的是对IgY进行保护，使其能够抵御胃环境刺激，但在腹腔环境中，其保护功能起到了阻碍IgY与病原菌结合的反作用，因此不及未进行微囊化的IgY有效。此外，腹腔注射为非临床常用给药方式，主要是为考虑本模型感染方式亦为腹腔注射感染，在IgY纳米粒-微球进行腹腔注射时，导致了部分小鼠死亡。剖检见腹腔脏器表面有酪样附着物，可见IgY纳米粒-微球进行腹腔注射会对动物机体造成负面影响，不宜进行腹腔注射给药。虽然IgY组中进行腹腔注射的小鼠未见异常，但在下一步的试验中，应在自然感染途径建立的模型中进行研究，同时应探索腹腔注射给药的安全性和必要性。同时，本试验对IgY纳米粒-微球进行设计时，为达到药物长时间在肠道保持高浓度的目的，快速释放时间为4 h。正常小鼠消化道排空时间约为20 min[16]，初生至60日龄仔猪胃排空时间长达1.5~19.0 h不等[17]，与小鼠的消化道排空时间有一定差异。IgY液的预防效果优于IgY纳米粒-微球的保护效果，原因也可能是IgY尚未缓释完全已被排出体外，进而造成肠道内药物浓度不足导致。因此，在今后类似模型的开发和评估中，应充分考虑不同日龄动物甚至不同类型动物在胃肠排空上的差异，在药物缓释时间设计上多做考虑。4结论本研究结果表明，IgY对小鼠的生长及免疫具有促进作用，抗大肠杆菌IgY及其纳米粒-微球制剂对小鼠大肠杆菌腹泻具有显著的预防作用，其预防效果包括IgY本身对抗原的结合，还包括对试验小鼠机体及免疫器官的整体促进作用。IgY及其纳米粒-微球制剂在给药方式选择上优先选择口服给药。进行IgY纳米粒-微球等保护、缓释剂型设计时，需考虑目标动物胃肠排空时间。