香菇是一种广泛栽培的食用真菌[1]，具有很高的食用和药用价值[2]，由于其独特的香味、口感和丰富的营养而深受人们喜爱[3-4]。香菇中含有较为丰富的多糖[5]。多糖是一类由多个单糖组成的天然高分子化合物[6]。研究表明，香菇多糖具有广泛的生物学功能[7]，能够起到免疫调节、抗肿瘤[8]、抗氧化、抗菌[9]和抗病毒等作用[10]。在抗菌活性方面，香菇多糖对多种致病菌具有抑制或杀灭作用[11]。这一特性使得香菇多糖在动物生产和保健中具有巨大的应用潜力[12]。动物生产中，香菇多糖可以作为一种新型饲料添加剂，用于提高动物的健康状况和生产性能[13]。香菇多糖通过调节肠道微生物群落，提高动物的免疫力[14]。万志成等[15]研究表明，在仔猪日粮中添加0.02%香菇多糖可以在应激急性期激活断奶仔猪肌肉组织中的Toll样受体4（TLR4）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）信号通路，增强机体免疫力，同时调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）/叉头转录因子（FOXO）信号通路相关基因表达，减缓肌肉蛋白质分解。目前，香菇多糖的提取方法包括热水提取、酸水解、酶法提取、超声波辅助提取等[16-18]，但鲜有使用超微粉碎辅助超声的方法提取香菇多糖的研究。因此，本研究以香菇为研究对象，采用超微粉碎辅助超声法提取多糖，研究不同因素对香菇中多糖提取率的影响，优化提取工艺参数，对香菇多糖的体外抗菌活性进行试验研究，为其在动物生产中的应用提供依据。1材料与方法1.1试验材料与仪器本试验所用香菇购自四川锦诚汇食品有限公司。试验所用8种指示菌均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株名和保藏号分别为：大肠杆菌（Escherichia coli，CICC 24106）、黑曲霉（Aspergillus niger，CICC 40373）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC 10301）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，CICC 23291）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CICC 1251）、青霉（Penicillium，CICC 40628）、沙门氏菌（Salmonella，CICC 21492）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus，CICC 10209）。鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）为本实验室保藏。石油醚、无水乙醚、苯酚、浓硫酸、氯仿和无水乙醇等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。琼脂粉、蛋白胨、牛肉膏等均购自青岛德慧海洋生物科技有限公司。试验仪器：30-B普通粉碎机（常州市益瑞干燥设备有限公司），XL-30C超微粉碎机（济南好来宝医疗器材有限公司），KH22R高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司），R-1010旋转蒸发仪（巩义市京华仪器有限责任公司），YX-280高压灭菌锅（成都普汇捷实验室设备有限公司），JC-100电热恒温培养箱（青岛精诚仪器仪表有限公司），SH-6600紫外分光光度计（江苏盛奥华环保科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1香菇样品预处理将香菇剪成约2 cm碎块，置于恒温烘箱中60 ℃烘干12 h，粉碎，过60目筛后得到香菇干粉样品。利用石油醚将香菇干粉样品在索氏抽提装置中进行脱脂处理，30~60 ℃下回流脱脂3次，过滤后置于105 ℃烘箱中烘干，将脱脂后的样品置于-20 ℃冰箱保存备用。1.2.2香菇多糖提取工艺流程将1.2.1中制备好的香菇干粉样品置于超微粉碎机中，进一步将样品粉碎至10~20 μm。精确称取10.000 g香菇超微干粉样并置于容器中，再以15 mL/g的液料比加入蒸馏水，与样品充分混合均匀。利用超声波水浴恒温振荡器，在50 ℃下，以200 W功率对调浆后的样品超声处理15 min。将超声处理后的样品置于离心机中，12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至旋转蒸发仪中，100 ℃下回流提取4 h，至溶液体积浓缩至原体积20%，待溶液冷却后，加入3~4倍于样品溶液体积的无水乙醇进行醇沉，在4 ℃的冰箱中静置24 h后取出，抽滤，将得到的沉淀用无水乙醇、丙酮和无水乙醚反复洗涤2~3次，冷冻干燥得到粗多糖。本研究中，以葡萄糖溶液作为标准物质，采用苯酚-硫酸法[19]测定香菇多糖的含量。首先，将葡萄糖粉末干燥至恒重，精确称取100.0 mg并将其置于100.0 mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解后定容，得到1.0 g/L葡萄糖标准溶液。制备5种不同浓度梯度的标准溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L）。分别取1.0 mL各浓度葡萄糖溶液置于10 mL比色皿中，加入1 mL 5%苯酚溶液，混合均匀后，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀后静置10 min，再置于水浴中加热30 min，待冷却至室温后，在490 nm的波长下测定其吸光度。根据测得的吸光度及对应的葡萄糖溶液浓度绘制标准曲线，得到回归方程：y=0.020 1x+0.019 4，R2=0.994 7。取上述香菇多糖样品，蒸馏水溶解后，按照苯酚-硫酸法检测其吸光度，代入方程计算样品中的多糖含量。每个试验组菌渣中多糖得率计算方法为：多糖得率=多糖含量菌渣质量×100% (1)1.2.3单因素试验设计本研究以1.2.2中香菇多糖提取工艺流程为基础条件，采用单因素轮换法，依次改变下述4个工艺参数：（1）液料比5、10、15、20、25、30 mL/g；（2）超声功率100、150、200、250、300、350 W；（3）超声时间5、10、15、20、25、30 min；（4）超声温度30、40、50、60、70、80 ℃。每组试验均设置3个平行试验，提取率取3次试验平均值。1.2.4正交试验设计以单因素试验结果为依据，结合SPSS设计的4因素4水平L16（44）正交试验表进行正交试验[20]。各正交试验组合均设置2次平行试验。正交试验因素水平设计见表1。以液料比（mL/g）、超声功率（W）、超声时间（min）和超声温度（℃）为研究对象，香菇多糖提取率为指标，探究香菇多糖提取过程中，最佳提取工艺参数组合，并以此条件进行验证试验，证实该工艺参数组合对多糖提取率的提升效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T001表1正交试验因素与水平设计水平A液料比/(mL/g)B超声功率/WC超声时间/minD超声温度/℃11520015402202502050325300256043035030701.2.5最优工艺组合下多糖提取率及其体外抑菌活性采用最优工艺参数组合对香菇多糖进行提取，试验设6次重复。对获得的香菇多糖体外抑菌活性进行检测，主要对抑菌活性和最小抑菌浓度进行检测。采用牛津杯法测定抑菌活性，利用电子游标卡尺测量抑菌圈直径，比较香菇多糖对9种指示菌的实际抑制效果，每组设3个平行。最小抑菌浓度检测在牛津杯法的基础上，采用2倍稀释法进行最小抑菌浓度的测定。配置5个梯度浓度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 g/L）的香菇多糖溶液，重复上述试验流程，利用电子游标卡尺测量不同浓度下，香菇多糖对指示菌的抑菌圈直径，考察其对不同菌种的最小抑菌浓度。1.3数据统计与分析利用Excel软件对所有试验结果进行记录、整理和统计。利用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用软件中的极差分析和多因素方差分析模块，对正交试验数据进行统计分析，Duncan's法进行多重比较，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1液料比对香菇多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，香菇多糖提取率随着液料比的升高，呈现先逐渐增大后下降的趋势。当液料比达到20 mL/g时，香菇多糖的提取率最高（11.63%）。当液料比为15、25、30 mL/g时，香菇多糖的提取率仅次于20 mL/g处理组。因此，在后续正交试验中，液料比的水平选择15、20、25、30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.F001图1液料比对香菇多糖提取率的影响2.1.2超声功率对香菇多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，香菇多糖提取率随着超声功率的提高，呈现先逐渐升高后保持平稳的趋势。当超声功率达到250 W时，香菇多糖的提取率最高（11.08%）。当超声功率为200、300、350 W时，香菇多糖的提取率仅次于250 W处理组。因此，在后续正交试验中，超声功率水平选择200、250、300、350 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.F002图2超声功率对香菇多糖提取率的影响2.1.3超声时间对香菇多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，香菇多糖提取率随着超声时间的延长，呈现先升高后下降的趋势。当超声时间为20 min时，香菇多糖的提取率达到最高（11.27%）。当超声时间为15、25、30 min时，香菇多糖提取率仅次于20 min处理组。因此，在后续正交试验中，超声时间水平选择15、20、25、30 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.F003图3超声时间对香菇中多糖提取率的影响2.1.4超声温度对香菇多糖提取率的影响（见图4）由图4可知，香菇多糖的提取率随着超声温度的增加，呈先逐渐升高后逐渐下降的趋势。当超声温度达到60 ℃时，香菇多糖的提取率最高（10.87%）。当超声温度为40、50、60 ℃时，香菇多糖提取率仅次于60 ℃处理组。因此，在后续正交试验中，超声温度水平选择40、50、60、70 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.F004图4超声温度对香菇多糖提取率的影响2.2正交试验结果正交试验极差分析结果见表2。在4个影响香菇多糖提取率的因素中，依据各因素R值排序可知，不同因素对香菇多糖提取率的影响重要性依次为：液料比超声功率超声时间超声温度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T002表2正交试验极差分析结果项目A料液比B超声功率C超声时间D超声温度多糖提取率/%平行1平行2均值111119.509.119.312122210.9810.5510.77313339.429.039.234144411.9811.5811.785212310.6610.2710.47622149.258.879.067234110.149.769.958243210.199.8410.029313411.5611.1511.3610324310.6510.2510.4511331211.2410.8511.0512342112.0611.6811.871341428.738.328.531442319.409.009.2015432410.4410.0710.2616441310.6210.2210.42K141.0839.6639.8340.32K239.4939.4743.3640.36K344.7240.4839.8040.56K438.4044.0840.7042.45k110.279.929.9610.08k29.879.8710.8410.09k311.1810.129.9510.14k49.6011.0210.1810.61R1.581.150.890.53对所有试验组的2次平行试验结果进行多因素方差分析，结果见表3。由表3可知，液料比和超声功率均对香菇多糖提取率有极显著影响（P0.01）；超声时间对香菇多糖提取率有显著影响（P0.05）；而超声温度对香菇多糖提取率无显著影响（P0.05）。综合极差分析和方差分析结果，以k值为依据，选择各影响因素中k值最大的结果为最优参数水平，则在香菇多糖的提取过程中，最优的生产工艺参数组合为A3B4C2D4：液料比25 mL/g、超声功率350 W、超声时间20 min和超声温度70 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T003表3正交试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型3 349.62913 349.6299 643.8790.000 0A液料比11.43033.81010.9700.000 2B超声功率6.93532.3126.6550.002 9C超声时间4.22231.4074.0520.022 0D超声温度1.57230.5241.5090.224 4误差6.599190.347注：R²=0.785；F0.05（3，19）=3.13，F0.01（3，19）=5.01。2.3最优工艺条件下香菇中多糖的提取率根据2.2中得到的最优工艺组合：液料比25 mL/g、超声功率350 W、超声时间20 min和超声温度70 ℃，以此条件重新进行香菇多糖的提取（6次），检测其香菇多糖的提取率，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T004表4最佳工艺参数条件下香菇多糖提取率项目123456平均值多糖提取率14.1414.4614.2714.2314.1413.9814.20%由表4可知，在最优生产工艺组合条件下，香菇多糖提取率达14.20%，相较单因素方差试验和正交试验中获得的香菇多糖提取率有明显提升。2.4香菇中多糖的体外抑菌效果2.4.1抑菌圈直径检测（见表5）由表5可知，香菇多糖提取物对9种指示菌中的7种表现出抑制作用，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等抑制作用较为明显，抑菌圈直径分别为9.73、11.03、10.94、10.43 mm。特别是对大肠杆菌的抑制作用最为突出，对其抑菌直径达13.63 mm。香菇多糖提取物对2种真菌类指示菌（黑曲霉与青霉）无抑菌作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T005表5香菇多糖体外对9种菌株的抑菌圈直径菌株种类抑菌直径无菌水对照大肠杆菌13.63±1.35—藤黄微球菌11.03±1.72—枯草芽孢杆菌10.94±0.72—酿酒酵母10.43±1.84—沙门氏菌10.35±0.81—金黄色葡萄球菌9.73±0.98—鸡白痢沙门氏菌8.46±1.18—黑曲霉——青霉——注：“—”表示无抑菌效果；下表同。mm2.4.2香菇多糖的最小抑制浓度（见表6）选取香菇多糖可抑制的7种指示菌，利用梯度浓度进一步研究香菇多糖对其最小抑制浓度。由表6可知，香菇多糖对7种指示菌的抑菌效果随着浓度上升呈现逐渐上升的趋势，但不同菌种的上升速度略有不同。结果表明，香菇多糖对于大肠杆菌抑菌浓度只需1.25 g/L，说明香菇多糖对大肠杆菌抑菌作用最强。对鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌的最小抑制浓度均为2.5 g/L；对酿酒酵母和沙门氏菌的最小抑制浓度均为5.0 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.017.T006表6香菇多糖对7种菌株的最小抑菌浓度菌株种类浓度/(g/L)0.6251.2502.5005.00010.000大肠杆菌-+++++++++鸡白痢沙门氏菌--+++++金黄色葡萄球菌--++++++枯草芽孢杆菌--++++++酿酒酵母---+++沙门氏菌---+++藤黄微球菌--+++++注：“+”“++”“+++”分别表示抑菌圈直径在6~8、8~10、10 mm以上。3讨论在动物日粮中添加香菇多糖可以提高营养物质的吸收，调节生长激素，进而提升动物的生长性能[21-22]。本研究以香菇为研究对象，对香菇样品进行超微粉碎处理后，采用超声波法提取香菇多糖。本研究结果显示，最优工艺组合下，香菇中多糖的提取率为14.20%。付丽娜等[23]直接通过超声波法提取香菇多糖，最优提取工艺条件下（液料比50 mL/g、超声功率300 W、提取温度50 ℃、超声时间40 min），香菇中多糖提取率为11.73%。本研究的香菇多糖提取率比付丽娜等[23]的提取结果提高了21.06%。秦令祥等[24]以香菇为研究对象，采用超声波协同复合酶法提取香菇多糖，最优提取工艺条件下（超声条件：液料比15 mL/g、超声温度70 ℃、超声时间12 min；酶解条件：酶解时间50 min、复合酶添加量3%、酶解温度60 ℃、酶解pH值5.5），香菇多糖提取率为12.46%。与上述研究相比，本研究所用方法对香菇中多糖的提取率也有较为明显的提高，说明在香菇多糖的提取过程中，可以选择超微粉碎法替代复合酶法，以达到减少工艺步骤、节约提取成本的效果。上述结果均表明，对香菇进行超微粉碎预处理可以有效提高香菇多糖得率，提高产量。原因可能是超微粉碎使香菇干粉颗粒大小降低至微米级，使物质结构更加疏松，并且使香菇样品颗粒在溶液中有更大的反应面积，不仅有利于香菇多糖的释放，同时提升整体加速反应速度，从而提高生产效率和多糖得率[25]。影响香菇中多糖提取率的4个因素，其重要性依次为：液料比超声功率超声时间超声温度；最优工艺参数组合：液料比25 mL/g、超声功率350 W、超声时间20 min和超声温度70 ℃。正交试验和方差分析结果显示，液料比和超声功率均对香菇多糖的提取率有极显著影响；超声时间则对其提取率有显著影响；而超声温度对香菇多糖的提取率无显著影响。因此，在不同生产条件和环境下开展香菇多糖提取生产之前，应进行详细的试验和论证，以获得该环境下的最优工艺参数水平，确保获得最高的产量。另外，还可以采用响应面分析法进一步改进本研究，以获得各影响因素更精确的工艺参数水平[26]。饲喂香菇多糖能够加快动物免疫系统成熟，提升动物的早期免疫功能，增强抗病力，有效降低动物因免疫力差导致的死亡风险[27-28]。本研究结果显示，香菇多糖具有一定的抑菌活性，对9种指示菌中的7种均表现出抑制作用，特别是对大肠杆菌的抑制效果最好，香菇多糖对大肠杆菌抑菌直径达13.63 mm，对大肠杆菌抑菌浓度则只需1.25 g/L。此外，香菇多糖对7种指示菌的抑菌效果随着浓度上升呈现逐渐上升的趋势。上述结果与汤强等[29]和何皎等[30]研究结果相似。上述结果表明，从香菇中提取得到的多糖抑菌谱较为广泛，在动物保健和抑菌等方面可能均有较好的效果。因此，利用香菇生产饲用多糖作为一种新型、天然的抑菌剂具有良好的开发前景。4结论本研究以香菇为研究对象，采用超微粉碎辅助超声波法提取多糖，利用正交分析法优化其提取工艺。结果显示，4个影响香菇多糖提取率的因素重要性依次为：液料比超声功率超声时间超声温度；最优提取工艺参数组合为：液料比25 mL/g、超声功率350 W、超声时间20 min和超声温度70 ℃。此工艺条件下，香菇多糖提取率为14.20%。体外抑菌试验显示，香菇中提取得到的多糖具有广谱抑菌性，特别是对大肠杆菌的抑制效果较好。