随着畜禽养殖业逐渐向高度集约化方向发展，畜禽疾病也趋向复杂化，造成畜禽生产力大幅度下降[1]。疾病暴发对养殖业造成极大冲击，影响畜禽食品安全[2]。抗生素是能够干扰细胞发育的一类化学物质[3]，对病原微生物具有抑制或杀灭作用[4]。抗生素滥用会导致动物机体不能完全代谢从而产生残留，严重影响畜禽食品安全[5-6]。农业农村部第194号公告指出，我国饲料全面禁用抗生素[7]。天然植物提取物具有无毒副作用、无残留、能够有效提高饲料利用效率等优点[8-9]，具有极好的替抗潜力。甘草具有清热泻火、凉血解毒、止咳化痰、调和诸药的功效[10-11]，甘草酸是甘草的主要活性成分之一[12]，饲粮中添加甘草提取物后可抑制畜禽体内促炎因子的表达，从而提高畜禽的抗炎能力[13]。研发新型饲料原料应对畜牧业中抗生素滥用导致的畜禽机体药物残留迫在眉睫。甘草党参粗提物是由甘草和党参两味中药材制备而成的天然植物粗提物，可用于畜禽生长的各个阶段，能够有效代替临床中抗生素的使用。为保证产品质量和稳定，探究并建立其有效活性成分的含量检测方法，具有重要意义。本试验通过线性关系、精密度、准确度和稳定性等方法学，应用高效液相色谱法进行考察，建立了饲料原料甘草党参粗提物的甘草酸含量测定方法，以期为液态天然植物粗提物饲料原料中甘草酸的质量控制提供参考。1材料与方法1.1仪器与试剂1260Ⅱ型高效液相色谱仪和紫外检测器（安捷伦科技（中国）有限公司），AUW220D型分析天平（岛津国际贸易有限公司），GM-0.33A隔膜真空泵（天津津腾试验设备有限公司），KH-500E超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），GC-20L-DI型超纯水机（深圳市广川科技有限公司）。甘草酸铵对照品（110731-202122，特性量值：94.4%），甘草党参粗提物（自制，批号为20220701~20220706）。甲醇、冰乙酸为色谱纯，水为超纯水，醋酸铵为分析纯。1.2试验方法1.2.1样品制备甘草和党参购自安国药材市场，按照《中华人民共和国兽药典》进行鉴定、检测，入库保存。阳性样品制备：取上述药材加水煎煮2次，合并煎液，静置，过滤，浓缩，罐装，灭菌，即得阳性样品。阴性样品制备：取上述药材除去甘草后加水煎煮2次，合并煎液，静置，过滤，浓缩，罐装，灭菌，即得阴性样品。1.2.2供试品溶液制备精密量取本品10 mL，置于50 mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀、过滤，即得供试品溶液。静置，取上清液，对甘草酸进行色谱分析。1.2.3阴性对照溶液制备取不含甘草药材的阴性样品，按1.2.1项下方法制备相应的阴性对照溶液。1.2.4对照品溶液制备精密称定甘草酸铵对照品适量，加流动相制成每1 L含0.25 g的溶液（相当于每1 L含甘草酸0.244 875 g），即得对照品溶液。1.2.5液相色谱条件波长检测范围：精密称取甘草酸铵对照品，加入流动相适量，稀释成0.25 g/L的溶液。用不同波长进行扫描，得出甘草酸的最大吸收波长为250 nm。溶剂的选择：精确量取本品10 mL，置于50 mL容量瓶内，分别选取70%乙醇、75%甲醇、稀乙醇、纯甲醇、纯乙醇、40%甲醇、流动相（甲醇-0.2 mol/L醋酸铵-冰乙酸为67∶33∶1）进行定容。色谱条件：采用Agilent-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，并以甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰乙酸（67∶33∶1）为流动相。检测波长250 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量10 μL。1.2.6专属性试验按照1.2.5项下色谱条件，精确注入10 μL甘草酸铵对照溶液、供试品溶液和甘草阴性对照溶液，观察甘草酸峰延续时长，观察甘草阴性对照溶液是否有异常峰形出现，通过专属性试验验证甘草党参粗提物中的其他成分是否会对甘草酸含量检测产生干扰。1.2.7线性关系考察取甘草酸铵对照品，精密称定20 mg，置于20 mL容量瓶内，加流动相（甲醇-0.2 mol/L醋酸铵-冰乙酸为67∶33∶1）溶液稀释，定容至刻度，充分振摇使药液混匀，得到1 g/L的甘草酸铵对照品溶液。加流动相进行稀释，将上述1 g/L的甘草酸铵对照品依次稀释为质量浓度0.50、0.20、0.10、0.05 g/L的样品试液，吸取上述试液各10 μL，采用高效液相色谱法检测，记录甘草酸铵对照品不同浓度的峰面积。1.2.8精密度试验取甘草酸铵对照品，精密称定，加入适量的流动相，使稀释成0.25 g/L的溶液，吸取甘草酸铵对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复检测并记录数据。1.2.9重复性及稳定性试验按照1.2.2、1.2.4、1.2.5方法对制备的6份甘草党参粗提物的甘草酸进行试验，对不同时间段的甘草酸含量变化进行检测，计算含量及相对标准偏差值。1.2.10加样回收率试验取甘草党参粗提物样品，分成6份，分别加入已知定量的甘草酸对照品溶液，按照1.2.2供试品溶液制备法制备待测样品溶液，并按照1.2.5色谱条件测定6份样品的甘草酸含量，最终根据试验结果计算甘草酸加样回收率。1.2.11样品含量测定按照1.2.2供试品溶液制备方法及1.2.5色谱条件，取6批不同的样品，对6批样品中的甘草酸进行分析，计算含量，并对结果进行统计分析。2结果与分析2.1专属性试验结果取甘草党参粗提物样品，按照上述制备方法制备供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液，并对待测样品进行检测，研究甘草酸对照峰的位置，检验阴性空白对照溶液是否出现杂质峰现象，检测结果见图1~图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.F001图1甘草酸铵对照品HPLC色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.F002图2甘草党参粗提物样品HPLC色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.F003图3阴性对照样品HPLC色谱图由图1~图3可知，检测结果表明建立的高效液相色谱法对甘草党参粗提物中甘草酸含量检测具有专属性。2.2线性关系考察按照1.2.2、1.2.4、1.2.5的试验方法检测甘草酸的含量，记录甘草酸的峰面积。线性关系考察结果见表1，甘草酸铵标准曲线见图4。由表1、图4可知，甘草酸高效液相色谱检测的线性回归方程为Y=7 775.2X-10.3，r=0.999 9。检测结果表明，甘草酸铵在0.05~1.00 mg之间具有准确的线性关系。。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T001表1线性关系考察结果甘草酸含量/(g/L)0.050.100.200.501.00峰面积/(mAU/min)383.066788.1061 580.6373 969.9857 967.31010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.F004图4甘草酸铵标准曲线2.3精密度试验测定结果（见表2）由表2可知，通过对6批甘草党参粗提物进行试验，甘草酸峰面积RSD为0.037%，表明研究方法和试验条件选择合理，符合精密度试验要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T002表2精密度试验测定结果试验次数峰面积/(mAU/min)甘草酸/(g/L)RSD/%11 962.1990.250.03721 962.1510.250.03731 962.3940.250.03741 963.9290.250.03751 961.8500.250.03761 962.5130.250.0372.4重复性试验结果（见表3）由表3可知，对6份相同批次的样品进行检测，测得甘草酸峰面积RSD为0.720%，表明该检测方法重复性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T003表3重复性试验结果试验次数峰面积/(mAU/min)甘草酸/(g/L)RSD/%12 703.4040.250.72022 688.8440.250.72032 693.2380.250.72042 718.5570.250.72052 684.4870.250.72062 660.7340.250.7202.5稳定性试验研究结果（见表4）由表4可知，在不同时间段内对同一批甘草党参粗提物甘草酸含量进行检测，RSD为0.185%，表明建立的高效液相色谱法对甘草党参粗提物中的甘草酸检测具有较强的稳定性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T004表4稳定性试验研究结果试验次数峰面积/(mAU/min)甘草酸/(g/L)RSD/%12 704.6190.250.18522 714.7750.250.18532 719.0470.250.18542 712.1600.250.18552 712.4350.250.18562 716.8860.250.1852.6回收率试验结果（见表5）由表5可知，根据实际检测数据分析，甘草酸平均回收率为96.09%，RSD为1.13%，表明检测方法具有较好的准确性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T005表5回收试验结果试验次数样品含量/(g/L)对照品加入量/(g/L)测定值/(g/L)回收率/%平均回收率/%RSD/%11.690 41.4373.044 994.2696.091.1321.690 41.4373.063 495.5531.690 41.4373.068 295.8841.690 41.4373.084 096.9851.690 41.4373.084 196.9961.690 41.4373.082 796.892.7样品检测结果对6个不同批次的样品进行检测，验证检测方法是否能够应用于甘草酸含量检测。不同批次产品中甘草酸含量检测结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.023.T006表6不同批次产品中甘草酸含量检测结果（n=6）样品批号甘草酸含量/(g/L)RSD/%202207012.3633.03202207022.277202207032.362202207042.248202207052.383202207062.217由表6可知，不同批次的甘草党参粗提物甘草酸含量检测结果不具备显著性差异，表明该试验检测方法可以应用于甘草党参粗提物甘草酸含量检测。3讨论常用的中兽药质量控制方法包括薄层色谱法、显微鉴别法[14]，虽然上述方法具有操作方便、设备简单、较易辨识等特点，但是存在只能定性不能定量的问题。如药品检测时，天气、试验室条件以及试验人员操作等因素均会对检测结果产生较大影响[15]，此外对中兽药制剂中的某种成分进行检测，制剂中其他成分会对待测成分产生干扰现象，使中兽药制剂待测成分检测结果存在无法避免的误差[16]，严重时甚至造成中兽药制剂的质量安全问题，在临床中具有潜在的安全问题。因此，本研究应用高效液相色谱法对甘草党参粗提物的甘草酸进行检测，能够有效提高产品质量水平，保障产品质量安全，提高产品成分检测的稳定性，消除临床风险。高效液相色谱法具有精确度高的优点[17]，紫外检测器可达0.01 ng，进样量在微升数量级，在生物制品、环境检测、农产品检测等领域均有应用[18]。甘草酸是甘草党参粗提物中一个重要的活性成分，主要功能是清热解毒、祛痰止咳[19]。有研究表明，甘草提取物的活性成分具有抗炎、抗氧化、免疫调节等多种药理作用[20]，广泛应用于临床，具有作为饲料添加剂开发利用的潜力[21]。4结论本试验以甘草党参粗提物中的甘草酸为研究对象，采用高效液相色谱法，在甲醇-0.2 mol/L醋酸铵-冰乙酸（67∶33∶1）为流动相，检测波长为250 nm的条件下对甘草酸定量检测，试验建立的甘草酸高效液相色谱检测方法线性关系良好，阴性对照无干扰，专属性好，精密度、重复性和加样回收率试验等RSD值全部在2%以内，符合方法学考察要求。