丁酸梭菌（Clostridium butyricum）为梭菌属革兰氏阳性厌氧菌，是人和动物常见的一种肠道共生菌，广泛存在于粪便、土壤和干酪等介质中[1-2]。丁酸梭菌产生的丁酸可直接作为能量物质被肠上皮细胞利用，且具有抑制致病菌生长、促进肠道健康、提高机体免疫力等作用[3-6]。目前，微生物饲料添加剂中丁酸梭菌的测定尚无统一标准。文献、团体标准和企业标准中检测丁酸梭菌的主要方法包括选择培养基筛选、生化鉴定和PCR鉴定等。不同方法的分离率、准确度和时效性等具有较大差异[7-8]。本文以丁酸梭菌标准菌株ATCC 19398菌液为模拟样本，分别对其进行了选择计数培养、生化鉴定、分子生物学鉴定和MALDI-TOF MS鉴定等，确定微生物饲料添加剂中丁酸梭菌测定的最优方法，并开展市售样品测定，为保障丁酸梭菌饲料添加剂的产品质量提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株及市售样品丁酸梭菌标准菌株ATCC 19398、大肠埃希菌标准菌株ATCC 8739。2批次丁酸梭菌饲料添加剂均为市售产品，分别编号A、B，其中A仅含丁酸梭菌，B含丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌。A中丁酸梭菌标示量大于1.0×109 CFU/g，B中丁酸梭菌标示量大于2.0×109 CFU/g。1.1.2培养基亚硫酸铁琼脂、TSC琼脂、TSN琼脂、强化梭菌固体培养基（RCM琼脂）均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。培养基种类及主要成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.T001表1培养基种类及主要成分培养基主要成分灭菌后另加物亚硫酸铁琼脂胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸高、柠檬酸铁铵、焦亚硫酸钠、琼脂无TSC琼脂胰胨、大豆胨、酵母粉、柠檬酸铁铵、焦亚硫酸钠、琼脂D-环丝氨酸TSN琼脂胰蛋白胨、酵母浸粉、亚硫酸钠、柠檬酸铁、多黏菌素B、硫酸新霉素、琼脂无1.1.3主要仪器恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），PCR扩增仪（美国ABI），Light Cycler 480 Ⅱ荧光定量PCR仪（罗氏诊断），VITEK 2 Compact（法国生物梅里埃），微量生化鉴定管、2.5 L厌氧产气包和厌氧培养袋（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。1.2试验方法1.2.1模拟样本制备取新鲜培养的丁酸梭菌标准菌株ATCC 19398适量，加入0.85%灭菌生理盐水中制成3.0麦氏浊度的菌悬液。1.2.2选择计数培养取模拟样本1 mL加入9 mL无菌生理盐水中，制成1∶10稀释液，依次进行10倍梯度稀释。分别取10-4~10-6稀释度下菌液稀释液1 mL，加入无菌培养皿中，将冷却至45~50 ℃的亚硫酸铁琼脂、TSC琼脂和TSN琼脂分别加入无菌培养皿中，小心转动，充分混匀。每个稀释度的每种培养基接种2皿。凝固后倒置，36 ℃厌氧培养18 h。1.2.3生化鉴定生化试管鉴定：挑取典型菌落分别使用微量生化鉴定管进行淀粉水解、明胶液化、乳糖发酵、木糖发酵、山梨醇发酵和鼠李糖发酵试验，同时进行空白对照。全自动微生物鉴定系统鉴定：挑取典型菌落置于3 mL灭菌的0.45%氯化钠中，调节麦氏浊度至2.7~3.3，按照仪器操作规程上机检测。1.2.4分子生物学鉴定普通PCR：挑取典型菌落进行DNA提取，利用16S rRNA通用引物（27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'、1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行扩增，扩增条件参考亓秀晔等[9]的试验方法。扩增产物送至上海派森诺生物技术有限公司进行序列测定，利用NCBI中的BLAST程序对测序结果进行同源性比对。荧光定量PCR：挑取典型菌落进行DNA提取，利用董银萍等[10]文章中的引物探针及程序进行扩增。PCR扩增时以丁酸梭菌ATCC 19398为阳性对照，以无菌水为空白对照，以非丁酸梭菌菌株为阴性对照。供试菌株信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.T002表2供试菌株信息菌株名称拉丁名菌株来源菌株数量丁酸梭菌Clostridium butyricumATCC 193981分离株20艰难梭菌Clostridium difficile分离株1粪肠球菌Enterococcus faecalisATCC 292121屎肠球菌Enterococcus faeciumATCC 194341枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisCMCC 635011短小芽孢杆菌Bacillus pumilusCMCC 632021金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCC 260031藤黄微球菌Micrococcus luteusCMCC 280011大肠埃希菌Escherichia coliATCC 259221铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaATCC 278531乙型副伤寒沙门氏菌Salmonella paratyphi BCMCC 5009411.2.5MALDI-TOF MS鉴定挑取典型单菌落均匀涂布于靶板，滴加1 µL基质液，自然晾干后按照MALDI-TOF MS仪器说明上机操作，以大肠埃希菌ATCC 8739进行校准。1.2.6市售样品测定无菌称取样品25 g，加入装有225 mL灭菌生理盐水的无菌锥形瓶中，振荡至均匀，制成1∶10的稀释液，依次进行10倍梯度稀释。分别取样品的10-6、10-7、10-8稀释液进行平板计数和后续菌株鉴定，具体方法参照丁酸梭菌模拟样本操作。2结果与分析2.1选择计数培养丁酸梭菌的菌落在不同计数培养基中均呈黑色圆形。对3.0麦氏浊度的丁酸梭菌进行计数。结果显示，亚硫酸铁琼脂培养基计数结果最多，为7.4×106 CFU/mL，TSN琼脂培养基计数结果最少，为6.9×105 CFU/mL。丁酸梭菌在不同培养基中的形态见图1，平板计数结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.F001图1丁酸梭菌在不同计数培养基中形态10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.T003表3丁酸梭菌平板计数结果培养基平皿中菌落平均数/CFU计数结果/（CFU/mL）10-410-510-6亚硫酸铁琼脂多不可记7457.4×106TSC琼脂多不可记6066.0×106TSN琼脂69816.9×1052.2生化鉴定丁酸梭菌生化鉴定结果见表4。由表4可知，丁酸梭菌ATCC 19398可水解淀粉，发酵乳糖、木糖、葡萄糖、棉籽糖、水杨苷，不还原硝酸盐，不液化明胶，符合《伯杰氏系统细菌学手册》中丁酸梭菌特征。VITEK 2 Compact未能鉴定出丁酸梭菌，鉴定结果显示“unidentified”或“50%丁酸梭菌”。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.T004表4丁酸梭菌生化鉴定结果项目淀粉水解明胶液化硝酸盐还原乳糖木糖葡萄糖水杨苷棉籽糖结果+--+++++注：“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果。2.3分子生物学鉴定2.3.1普通PCR鉴定经16S rRNA通用引物扩增后测序，测序结果BLAST比对后结果显示，丁酸梭菌扩增结果比对相似度排名前10位均为丁酸梭菌，待测序列与已知丁酸梭菌序列相似度均大于97%。2.3.2荧光定量PCR鉴定丁酸梭菌ATCC 19398和实验室分离菌株经荧光定量PCR扩增后有典型扩增曲线，而艰难梭菌、粪肠球菌、屎肠球菌等无典型扩增曲线，丁酸梭菌荧光定量PCR扩增结果见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.F002图2丁酸梭菌荧光定量PCR扩增结果循环数2.4MOLDI-TOF MS鉴定丁酸梭菌ATCC 19398经鉴定为丁酸梭菌，置信99%。丁酸梭菌质谱结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.F003图3丁酸梭菌质谱图2.5市售样品测定市售样品菌落形态见图4。由图4可知，2批次市售样品在亚硫酸铁琼脂培养基上均有典型菌落。A仅见1种形态菌落。B有2种形态菌落，其中1种菌落典型显黑色，另1种菌落不典型未显黑色。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.F004图4市售样品菌落形态注：黑色为典型菌落，白色为非典型菌落。市售样品菌落计数结果见表5。A、B典型菌落计数结果分别为9.1×108、1.2×109 CFU/g。分别挑选2个典型菌落进行荧光定量PCR扩增，均有典型扩增曲线。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.024.T005表5市售样品菌落计数结果项目典型菌落平均数/CFU计数结果/(CFU/g)10-610-710-8A多不可记9189.1×108B多不可记120101.2×1093讨论3.1丁酸梭菌检测的计数培养基分析本研究比较亚硫酸铁琼脂培养基、TSC琼脂培养基和TSC琼脂培养基对丁酸梭菌的选择计数特性。3种培养基中均含（焦）亚硫酸钠和柠檬酸铁铵，丁酸梭菌可将（焦）亚硫酸钠还原为硫化钠，与柠檬酸铁铵反应生成黑色的硫化亚铁。TSN琼脂含有硫酸新霉素和多黏菌素B，TSC琼脂还含有D-环丝氨酸，这些成分对非丁酸梭菌细菌有一定抑制作用。试验结果显示，丁酸梭菌在3种培养基中均可生长，但相同稀释度下亚硫酸铁琼脂培养基中丁酸梭菌的菌落数最多。可能是因为TSC琼脂和TSN琼脂在有更好选择性的同时，对丁酸梭菌的生长也具有一定抑制作用。丁酸梭菌饲料添加剂产品中的菌种组成简单，一般仅含1~3种细菌，亚硫酸铁琼脂在具备一定选择性的同时也能保证细菌回收率，因此可作为计数培养基。3.2丁酸梭菌检测的鉴定方法分析3.2.1生化鉴定目前VITEK 2 Compact是市场上使用较多的全自动微生物生化鉴定仪器。本研究多次采用VITEK 2 Compact配套ANC卡对丁酸梭菌进行鉴定，均未能得到有效结果。因此，丁酸梭菌的生化鉴定宜选择生化鉴定管进行人工鉴定。本研究开展人工鉴定试验时发现，部分生化反应的空白对照也有颜色改变导致鉴定结果不准确，如鼠李糖和山梨醇发酵试验显阳性，而根据《伯杰氏系统细菌学手册》，以上两项结果应显阴性。这可能是厌氧培养条件下，大量CO2融入试剂改变了试剂pH值，使其颜色发生改变所致。因此，在开展生化试验时应注意排除可能影响结果的因素。3.2.2分子生物学鉴定对比普通PCR方法，荧光定量PCR具有步骤简单、可批量操作等优点，但目前丁酸梭菌的分子生物学鉴定主要以传统的16S rRNA扩增测序为主[11-13]。董银萍等[10]提供了一种丁酸梭菌荧光定量PCR的鉴定方法，对文中的引物探针进行BLAST比对发现其属于丁酸梭菌[Fe-Fe]氢酶（hydA）基因。该基因与丁酸梭菌产生氢气有关，是目前生物氢能源领域的热点研究之一[14-15]。按文章条件进行扩增，结果表明该基因具有良好种间特异性，可作为丁酸梭菌鉴定靶基因，是微生物饲料添加剂中丁酸梭菌测定的良好候选方法。3.2.3MALDI-TOF MS鉴定近年来，MALDI-TOF MS被广泛应用在细菌鉴定领域[16-18]。Young等[19]和Lucia等[20]先后利用MALDI-TOF MS对梭菌属细菌进行鉴定，其中包括丁酸梭菌。本研究显示，MALDI-TOF MS对丁酸梭菌有良好鉴定效果，但由于仪器成本较高、适用范围较小，因此不建议将该方法作为常规通用鉴定方法，如遇到特殊情况菌株种类难以判断可进一步选用MALDI-TOF MS进行验证。3.3市售样品中丁酸梭菌的测定分析利用亚硫酸铁琼脂培养基平板计数法结合荧光定量PCR法对2批次市售丁酸梭菌饲料添加剂进行测定，结果显示本方法对含丁酸梭菌单一菌种的产品和多个菌种的产品均能够进行有效测定。从2批次样品测定结果看，市售产品的实测活菌数低于标示活菌数，市售产品质量有待进一步加强。4结论本试验结果表明，亚硫酸铁琼脂培养基平板计数法结合荧光定量PCR可对微生物饲料添加剂中的丁酸梭菌进行有效测定。