紫花苜蓿（Medicago sativa）作为喂养奶牛的优质饲草，可以减少奶牛代谢病，使奶牛淘汰率下降5%，奶产量提高20%以上[1-2]。黑龙江省作为我国最大的乳品生产基地之一，是发展苜蓿产业的重要区域。但是，受该地区气候影响，苜蓿在越冬前需要经历一个冷适应阶段，这一过程由低温、短日照共同作用所引发[3]。低温使植物光合速率下降，引起光能过剩，致使过剩的激发能大量聚集光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心，进而损伤植物叶片PSⅡ反应中心，导致光抑制的发生及光合机构被破坏[4]。因此，低温会直接影响叶片光能的吸收、转换及光合电子传递等光合过程。光合作用是植物生长及产量形成的基础，作物产量90%以上来自光合作用所形成的有机物[5-6]，所以高寒地区秋季光照减少、气温下降，将导致不同苜蓿的生物学特性、农艺性状及抗冻性差异较大[7]。此前，有研究指出荧光参数可简便快捷地探测出不同苜蓿耐寒性强弱[8]。PSII的活性可影响苜蓿叶片光合器官的活性，叶片PSII光化学效率及潜在光化学效率均会随低温胁迫时间的延长而呈现明显下降[4,9-10]。目前，关于越冬前期不同秋眠性苜蓿光合活性差异的研究较少。本研究选取不同秋眠级苜蓿品种为试验材料，测定苜蓿晚秋叶片初始荧光、光化学效率、光化学淬灭系数等指标，探究低温、短日照环境下不同秋眠级苜蓿光合活性的变化规律，进而解析不同苜蓿的光合能力差异，旨在为寒区苜蓿新品种选育提供参考。1材料与方法1.1试验地概况试验地位于齐齐哈尔市富拉尔基（E 123°24′，N 47°9′），最低温度-39.5 ℃，年均气温3 ℃，积温（≥10 ℃）2 722.1 ℃，年均降水量约480 mm，无霜期约132 d。土壤为黑风沙土，有机质19.89 g/kg，全氮1.19 g/kg。1.2试验材料选取苜蓿材料6份。草原3号由内蒙古农业大学提供，龙牧801由黑龙江省农业科学院提供，皇后和赛迪由百绿（天津）国际草业有限公司提供，康赛和阿迪娜由中国农业科学院草原所提供。1.3试验设计试验周期为2021年6月至12月，试验小区面积15 m2（3 m × 5 m），采用随机区组设计，人工条播，行距30 cm，3次重复，以龙牧801为保护行。播前试验小区均未施底肥，播种后及时镇压。试验期间进行灌溉、除草、病虫防治等田间管理措施。越冬期前每隔60 d（冷适应：9月15日；冷胁迫：10月15日）田间选取的苜蓿叶片进行标记，以8月15日为对照，此后每次测定都选同一叶片，测定供试品种荧光参数指标。1.4测定指标及方法每日10：00—11：50用LI-6400光合测定仪测定叶片初始荧光（Fo）、光化学淬灭系数（qP）、可变荧光（Fv）、光系统Ⅱ（PSⅡ）光化学效率（Fv/Fm）、非光化学淬灭系数（qN）、PSⅡ潜在光化学效率（Fv/Fo）等叶绿素荧光参数。测定方法参见仪器说明书。1.5数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行处理，Sigma Plot 12.5软件作图，SAS 9.0软件进行单因素方差分析和相关性分析。应用模糊数学隶属函数法[11-12]，综合评价所测指标，求各项荧光指标隶属函数值。测定指标与苜蓿荧光特性呈正相关：Fij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)(1)测定指标与苜蓿荧光特性呈负相关：Fij=1-(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)(2)式中：Fij为i草种j指标值；Xij为i草种j指标隶属值；Ximax为i草种j指标最大值；Ximin为i草种j指标最小值。将i草种各项指标函数值累加，求平均值，均值越大品种光合性能越强，最后得出品种间光合性能强弱顺序。2结果与分析2.1供试品种叶片的Fo及Fv检测结果（见图1）由图1（a）可知，供试品种叶片的Fo值因冷胁迫强度增加而呈不同程度的升高。冷适应期，各苜蓿品种的Fo值差异较大，秋眠等级高的品种如阿迪娜和赛迪Fo值较高，分别比对照组高14.83%和14.88%；冷胁迫时，各品种的Fo值均呈现最高值，以赛迪的Fo值最高，草原3号和龙牧801的Fo值显著低于其他品种（P0.05）。结果表明，秋眠等级较高的品种Fo值上升幅度越大，对低温变化更为敏感；与之相反，秋眠等级低的品种如龙牧801和草原3号的Fo上升幅度较小，即PSII反应中心遭受破坏程度相对较轻，品种对冷适应能力更强。由图1（b）可知，寒冷环境下，各品种叶片Fv值整体呈现下降的变化趋势。冷适应期，龙牧801的Fv值最高，阿迪娜和赛迪的Fv值显著低于其他品种（P0.05）；冷胁迫时，各品种的Fv值明显低于对照组，其中龙牧801和草原3号的Fv值显著高于其他品种（P0.05），相比于Fv值最低的赛迪分别高9.65%和6.49%。图1供试品种叶片的Fo及Fv检测结果注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F1a1（a）Fo值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F1a2（b）Fv值2.2供试品种叶片的Fv/Fo及Fv/Fm检测结果（见图2）Fv/Fo和Fv/Fm是光化学反应的重要参数，常用于衡量植物叶片PSII光能转换效率。由图2（a）可知，寒冷环境下，各品种叶片Fv/Fo值整体呈现降低趋势。冷胁迫时，各品种Fv/Fo呈最低值，与对照组相比，降低19.72%~28.92%，且不同品种之间也存在明显差异，草原3号和龙牧801的Fv/Fo值显著高于其他品种（P0.05）。由图2（b）可知，寒冷环境下，各品种叶片的Fv/Fm值整体呈现降低趋势。与对照组相比，各品种冷适应期Fv/Fm值降低幅度较小，下降3.71%~6.98%；冷胁迫时，龙牧801的Fv/Fm值显著高于其他品种（P0.05），与Fv/Fm值最低的赛迪相比高1.04倍。结果表明，秋眠等级高的品种Fv/Fm值较低，即PSII原初光能转换效率相对较低，反之秋眠级较低的品种光能转换效率却较高。图2供试品种叶片的Fv/Fo及Fv/Fm检测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F2a1（a）Fv/Fo值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F2a2（b）Fv/Fm值2.3供试品种叶片的qP及qN检测结果（见图3）图3供试品种叶片的qP及qN检测结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F3a1（a）qP值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.F3a2（b）qN值qP表示反应中心的开放程度，qP值越大表明电子传递活性越强。由图3（a）可知，寒冷环境下，各品种叶片qP值整体呈现降低趋势。与对照组相比，各品种在冷适应期qP值降低幅度较小，下降0.63%~7.19%；冷胁迫时，所有品种的qP值与对照组相比降低14.11%~26.20%，阿迪娜和赛迪的qP值较低，显著低于其他品种（P0.05）。qN反映PSII天线色素吸收的光能以热的形式耗散的部分光能，qN值升高，有助于耗散过剩的激发能。由图3（b）可知，寒冷环境下，各品种叶片qN值整体呈现增加趋势。冷胁迫时，各品种qN值呈现最高值，与对照组相比增加23.09%~34.01%；阿迪娜和赛迪的qN值较高，分别是草原3号的1.05、1.06倍，草原3号的qN值显著低于其他品种（P0.05）。结果表明，秋眠级较高的品种qN值较高，qN值增高有助于耗散过剩的激发能以减缓秋季低温弱光对光合作用的影响。2.4供试品种叶片综合评价（见表1、表2）由表1可知，Fo值与Fv值、Fv/Fm、Fv/Fo、qP值之间存在极显著负相关（P0.01）；Fv/Fm与Fv/Fo、qP、Fv之间呈极显著正相关（P0.01）；Fv/Fo与qP之间存在极显著正相关（P0.01）。qP与qN之间呈极显著负相关（P0.01）。结果表明，苜蓿叶片的PSII结构和功能受到损伤程度越大，导致PSII光能转换效率和光化学电子传递活性减弱，进而影响了苜蓿的光合作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.T001表1相关性分析项目Fo值qP值qN值Fv值Fv/FoFv/FmFo值1.000qP值-0.810**1.000qN值0.863**-0.888**1.000Fv值-0.873**0.733**-0.750**1.000Fv/Fo-0.953**0.777**-0.824**0.978**1.000Fv/Fm-0.900**0.797**-0.882**0.901**0.934**1.000注：“**”表示在0.01水平极显著相关。由表2可知，利用隶属函数法对品种的荧光特性进行评价，得出光合性能强弱顺序为：龙牧801草原3号皇后康赛阿迪娜赛迪。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.025.T002表2隶属函数分析项目Fo值qP值qN值Fv值Fv/FoFv/Fm评价值排序草原3号0.5250.6510.4840.4370.4420.5190.5102龙牧8010.5720.6180.4470.4570.4410.6310.5281皇后0.5200.6130.4990.4200.4400.5190.5023康赛0.3790.6220.4040.5010.5940.4920.4994阿迪娜0.5280.6020.5450.4510.3450.4840.4935赛迪0.5150.5750.5400.4490.3950.4770.49263讨论Fo和Fv是叶绿素荧光参数的重要指标。苜蓿秋眠特性与其耐寒性及生产力具有直接的关联[13]。特别是秋季低温来临时，秋眠型苜蓿停滞生长，植株提前进入休眠状态以抵御严冬恶劣环境[7]。随着晚秋温度下降、光照减少，不同秋眠等级苜蓿品种的叶绿素荧光参数变化较大。本研究中，随着冷胁迫加剧，所有供试品种的Fv降低；与之相反，Fo值却呈现上升的趋势，同一冷胁迫下，秋眠等级高的品种皇后、康赛、阿迪娜和赛迪的Fo值较高，秋眠等级低的品种草原3号和龙牧801较低，与李超[14]的研究结果基本一致。研究表明，随着环境温度降低、光照时数减少，秋眠性弱的品种Fo上升幅度较大，PSII反应中心被破坏或可逆失活，光合受抑制程度较重，而秋眠性强的品种（草原3号和龙牧801）PSII反应中心遭受破坏程度却较轻[10]。Fv/Fm和Fv/Fo是光化学反应的重要参数，常用于衡量植物叶片PSII光能转换效率。叶绿素吸收光能和耗散光能的主要方式是通过叶绿素荧光、电子传递以及热耗散途径完成[15]。植株遭受逆境胁迫可导致光合器官出现暂时的光抑制或直接被逆境破坏，叶绿素荧光参数下降[16-17]。本研究中，随着冷胁迫加剧，所有品种的Fv/Fm呈现下降趋势，其中以龙牧801在冷胁迫时Fv/Fm最高，Fv/Fo的变化规律类似Fv/Fm；冷胁迫时，草原3号和龙牧801的Fv/Fo显著高于其他品种，且Fv/Fo与Fv/Fm存在很强的正相关关系，表明Fv/Fm和光能转化潜在活性的变化具有相关性与同步性[18]，即在同样的冷胁迫下，秋眠性强的品种如草原3号和龙牧801的有效光能转换效率和Fv/Fm较高，光化学反应受抑制程度较轻[8]。qP和qN是光合电子传递及光能转换的重要参数。qP表示反应中心的开放程度，其值越大，表明电子传递活性越强。qN反映PSII天线色素吸收的光能以热的形式耗散的部分光能[19]。本研究中，随着冷胁迫加剧，供试品种的qP值呈现降低趋势，反之qN值呈上升趋势，且Fv/Fm与qP值存在很强的正相关，而与qN值呈显著负相关，表明品种qP值越低，PSII天线色素所吸收的光能可用于光合电子传递的活性则越弱[7]。qN值增高有助于耗散大量的激发能以减缓低温对光合作用的影响，表明秋眠性较弱的品种（阿迪娜和赛迪）对秋季低温、短光照的变化更为敏感。同样寒冷环境下，秋眠型苜蓿的Fv/Fm高于半秋眠型和非秋眠型品种，表明Fv/Fm的降低幅度与苜蓿品种对低温的敏感性一致，Fv/Fm越高则苜蓿越能够有效地将吸收的光能快速转化成化学能，增强光合电子的传输效率，为碳同化提供所需能量和还原力[8]。综上所述，品种光合荧光特性研究为简单快捷评价及筛选耐冷苜蓿种质材料提供了参考。由于不同秋眠级苜蓿品种晚秋叶片光合活性对低温的响应程度不尽相同，所以需要选择适宜的评价方法对品种的光合性能进行评价。梁欢等[20]研究表明，叶绿素荧光参数是筛选抗旱苜蓿种质资源的主要指标，并运用隶属函数对14份苜蓿材料的抗旱性进行了评价。本研究亦采用隶属函数法对品种进行综合评价，最终得出龙牧801和草原3号的光合能力较强。4结论随着秋眠等级增加，苜蓿的Fv值、Fv/Fm、Fv/Fo、qP值均呈下降趋势，而Fo值和qN值则呈现上升的变化，经隶属函数评价得出各苜蓿品种光合能力强弱顺序依次为：龙牧801草原3号皇后康赛阿迪娜赛迪。