绿原酸（chlorogenic acid，CGA）是由咖啡酸和奎宁酸缩合而成的5-O咖啡酰奎宁酸[1]，广泛分布在咖啡、杜仲、金银花等植物中，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、抗诱变以及调节免疫等多种生物学活性[2]。目前，CGA广泛应用于农业、食品、医药等领域，且作为饲料添加剂在畜牧业生产中得到了有效利用[3]。CGA的来源主要包括植物提取和化学合成。从植物中提取的CGA面临植物生长周期长、提取工艺复杂、含量不稳定等问题，难以满足日益增长的市场需求；而化学合成易污染环境，对生态系统造成危害。因此，开拓获取CGA的新途径具有重要意义。利用合成生物学手段在微生物中生产CGA是一种潜在的工业化生产CGA的途径。研究报道，在大肠杆菌中导入CGA合成途径中的关键元件可获得高产CGA菌株[4-6]，但也有从植物中直接分离得到大量产CGA的菌株，如鼠疫菌[7]、镰孢霉菌和拟盘多毛孢菌属[8]、芽孢杆菌等[9-12]。自然界分离得到的野生菌株产CGA的量均较低[13]，探究菌株生长及产CGA最优条件是工业发酵生产CGA的前提。该研究以前期筛选保藏的产CGA菌株烟草肠杆菌（Enterobacter tabaci）N22[12]为试验菌株，利用常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma，ARTP）和紫外复合诱变获得高产CGA的菌株，并通过单因素与响应面结合的方法对发酵条件进行优化，旨在进一步提高CGA产量，为工业化发酵生产CGA提供了潜在的菌种资源。1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株来源烟草肠杆菌（Enterobacter tabaci）N22由本实验室前期筛选得到，-80 ℃冰箱保存。1.1.2主要试剂CGA标准品（上海源叶生物科技公司），乙腈、甲醇、冰乙酸（天津科密欧化学试剂有限公司），牛肉膏、蛋白胨（北京索莱宝科技有限公司），其他试剂（国药集团化学试剂有限公司）。1.1.3培养基筛选培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L、AlCl3 0.1 g/L，pH值7.2~7.4。种子培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.2~7.4。基础发酵培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.2~7.4。发酵培养基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L，pH值7.2~7.4。优化培养基：果糖31.06 g/L、玉米浆124 g/L、MnSO4 0.1 g/L、L-Tyr 1 g/L、VB1 0.003 g/L、CaCO3 3 g/L、Tween-80 0.05%，pH值7.2~7.4。1.1.4仪器设备旋转蒸发仪（广州艾卡仪器设备有限公司），超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司），高效液相色谱仪（美国Waters公司），恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），ARTP诱变仪（无锡源清天木生物科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1CGA产量测定CGA产量采用高效液相色谱法测定。C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm；JADE-PAK ODS-AQ；Echway Corporation)；Waters HPLC系统（e2695-2998）；流动相的A相0.5%乙酸，B相乙腈（0~5 min，95% A；5~15 min，92% A；15~20 min，50% A；20~21 min，10% A；21~25 min，95% A）。流速 1 mL/min；检测波长为327 nm；柱温35 ℃，进样量10 μL。1.2.2紫外诱变将培养至对数期的菌液进行梯度稀释，涂布于筛选培养基，置于已预热30 min的紫外灯下30 cm处进行2、4、6、8、10、12、14、16、18 s的照射，以照射0 s作为对照，37 ℃恒温培养箱中黑暗培养48 h后进行菌落计数，计算诱变致死率，绘制诱变致死曲线。致死率=(对照组菌落数-试验组菌落数)/对照组菌落数×100%(1)1.2.3ARTP诱变将培养至对数期的菌液进行梯度稀释，离心，弃上清，悬浮于1 mL生理盐水，制成诱变菌悬液。取诱变菌悬液10 μL置于诱变载片上，在功率130 W、气流量10 SLM下进行诱变处理，处理时间为20、50、120、180、240 s，以照射0 s作为对照。诱变处理完成后进行样品洗脱，稀释涂布于筛选培养基，菌落计数，计算诱变致死率，绘制致死曲线。1.2.4复合诱变按照1.2.3中的ARTP诱变方法在其最佳诱变时间的基础上进行诱变，涂布于筛选培养基后在最佳紫外诱变时间下进行诱变，37 ℃黑暗培养48 h。1.2.4.1平板初筛挑取初筛培养基上长势好且与基础培养基有颜色差异的菌株作为初筛菌株，分离保藏。1.2.4.2摇瓶复筛将已培养好的种子液按照1%的接种量接种至基础发酵培养基中，37 ℃、200 r/min发酵7 d。取发酵液20 mL破胞，10 000 r/min离心10 min。取上清液加入等体积的75%乙醇，调节pH值至2~3，室温浸提5 h，45 ℃真空浓缩至1 mL，加入1 mL甲醇，10 000 r/min离心10 min，过0.22 μm滤膜。HPLC测定CGA，具体方法见1.2.1，挑选CGA产量提高的菌株分离保藏。1.2.4.3突变株稳定性检测将突变株在基础培养基上连续传代5次，摇瓶发酵后测定CGA产量及菌体干重（dry cell weight，DCW）。1.2.5突变株AU-34发酵培养基的优化1.2.5.1单因素优化单因素优化发酵培养基成分，包括碳源、氮源、金属离子、氨基酸、维生素、表面活性剂和CaCO3。1.2.5.2Plackett-Burman试验以单因素试验为基础，选取影响AU-34产CGA的8个因素，设计两水平Plackett-Burman试验，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T001表1Plackett-Burman试验设计因素水平-11A果糖/(g/L)10.0030.00B玉米浆/(g/L)40.00120.00C ZnSO4/(g/L)0.100.20D MnSO4/(g/L)0.200.30E VB1/(mg/L)3.005.00F CaCO3/(g/L)1.003.00G L-Tyr/(g/L)0.201.00H Tween-80/%0.020.051.2.5.3最陡爬坡试验设计（见表2）以Plackett-Burman试验为基础，对影响CGA产量的显著因素进行分析，设计最陡爬坡试验，以期得到显著影响因素的最佳浓度。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T002表2最陡爬坡试验设计试验号A果糖B玉米浆C MnSO4110400.30215600.25320800.204251000.155301200.106351400.05g/L1.2.5.4Box-Behnken试验以最陡爬坡试验确定为基础，通过Box-Behnken设计得到突变菌株AU-34产CGA的最佳发酵参数，试验设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T003表3Box-Behnken试验设计水平A玉米浆B果糖C MnSO4-1100100.050120300.101140500.15g/L1.2.6生物量测定取发酵液10 mL加入50 mL的离心管中，10 000 r/min离心10 min，弃上清，加入去离子水洗涤，离心，沉淀置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，称量后计算DCW。1.3数据统计与分析本研究中试验均进行了3次平行试验，试验数据采用SPSS 24.0软件进行统计分析，Origin 2018绘图。Plackett-Burman和Box-Behnken试验采用Design-Expert 8.0.6软件进行试验设计与数据处理，Duncan's法进行多重比较，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1紫外与ARTP诱变致死曲线（见图1）随机诱变是改良菌株性能的主要方式之一，其原理是通过碱基缺失、替换等染色体异常的方式导致菌株发生突变，且正突变易在高致死率下得到[14-15]，但致死率过高会降低菌株筛选范围。因此，一般选取致死率在80%~90%之间的时间作为最佳诱变时间。由图1可知，本研究中烟草肠杆菌N22紫外诱变处理时间为8 s时，致死率达到87.6%，可作为后续最佳处理时间。在3轮紫外诱变基础上进行ARTP诱变，当诱变处理时间为180 s时，致死率达到85.81%，因此，以180 s为后续进行的最佳ARTP诱变时间。图1紫外与ARTP诱变致死曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F1a1（a）紫外诱变10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F1a2（b）ARTP诱变2.2菌株初筛结果（见表4）Al3+可通过酚酸基团与CGA的羧基部分配位，形成相对稳定的CGA-Al3+紫红色络合物[16-17]。由表4可知，在基础培养基中加入Al3+作为筛选培养基，对诱变后的菌株进行初步筛选与分离，通过3次紫外诱变、3次ARTP诱变及1次紫外-ARTP复合诱变后，初筛得到50株左右的诱变菌株。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T004表4菌株初筛结果诱变出发菌株初筛单菌落数第1轮紫外N2242第2轮紫外Z1-941第3轮紫外Z2-3944第1轮ARTPZ3-4545第2轮ARTPA1-3962第2轮ARTPA2-5948紫外-ARTPA3-45502.3菌株复筛将每轮初筛得到的50株左右的诱变菌株进行摇瓶发酵培养，选取CGA产量最高的菌株进行下一轮诱变，每轮不同菌株的CGA产量见图2。由图2可知，经过多次诱变及菌株复筛后得到1株高产CGA菌株AU-34，产量为4.70 mg/L，约为出发菌株N22的2.8倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F002图2不同菌株的CGA产量2.4AU-34菌株遗传稳定性检测（见图3）通过采取不同的诱变方式和合理的筛选方式可获得产量提高、适应力增强的突变菌株，以提高野生菌株合成产物的能力[18]。由图3可知，本研究获得的突变菌株AU-34连续传代5次后，CGA产量和DCW差异均不显著（P0.05），表明AU-34遗传稳定性较好，适用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F003图3AU-34菌株遗传稳定性检测结果2.5突变菌株AU-34生长状况及培养基成分分析2.5.1不同碳源和氮源对菌株AU-34产CGA和DCW的影响（见图4）图4不同碳源和氮源对菌株AU-34产CGA和DCW的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F4a1（a）碳源10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F4a2（b）氮源培养基成分对菌株的生长及产CGA的能力具有重要影响[19]。由图4（a）可知，30 g/L果糖对于促进菌体生长及CGA合成最显著。综合考虑，选取30 g/L果糖为菌株AU-34产CGA的最佳碳源。由图4（b）可知，蛋白胨、酵母提取物和玉米浆对菌株DCW和产CGA的能力产生了不同影响。以玉米浆作为氮源时，DCW随着玉米浆浓度增加逐渐增加，CGA产量则呈逐渐增加最后下降的趋势。当玉米浆浓度为120 g/L时，CGA产量显著提高，达99.85 mg/L，原因可能是玉米浆中含有多种成分，如多肽、蛋白质、氨基酸及生长因子等，对微生物生长以及代谢物分泌具有促进作用[20]。2.5.2金属离子、维生素和氨基酸对菌株AU-34产CGA和DCW的影响（见图5）由图5（a）可知，添加不同浓度磷酸盐、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Na+以及Ca2+对菌体生长和菌株AU-34产CGA的能力具有不同的效应，所有离子中，0.3 g/L MnSO4对于促进CGA合成作用最强。由图5（b）可知，不同维生素对菌体和CGA的产量也有一定的影响，当VB1浓度达到3.0 mg/L时，CGA产量最高为7.86 mg/L，较对照组提高了0.85倍。因此，以3.0 mg/L的VB1为AU-34生长和产CGA的最优维生素。由图5（c）可知，当L-Tyr的添加量为1.0 g/L时，CGA的产量达到最高为11.97 mg/L，菌体生长也较好，因此，选择1.0 g/L的L-Tyr为最优氨基酸。图5金属离子、维生素和氨基酸对菌株AU-34产CGA和DCW的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F5a1（a）金属离子10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F5a2（b）维生素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F5a3（c）氨基酸2.5.3表面活性剂和CaCO3对菌株AU-34产CGA和DCW的影响（见图6）适量表面活性剂的添加会促进菌体生长及代谢物的产生[21]。由图6（a）可知，当Tween-80的添加量为0.05%时，CGA产量达到最高为7.60 mg/L，因此，选择其作为最佳表面活性剂。由图6（b）可知，添加CaCO3促进了CGA产生，当添加量为3.0 g/L时，CGA产量最高，为11.03 mg/L。图6表面活性剂和CaCO3对菌株AU-34产CGA和DCW的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F6a1（a）表面活性剂10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F6a2（b）CaCO32.5.4Plackett-Burman试验结果（见表5、表6）为筛选出显著影响CGA合成的影响因子，按照Plackett-Burman试验设计原则，每个因子设置3个虚变量，对AU-34的培养成分进行优化，共获得12个试验组合，以CGA产量作为响应值。对表5试验结果进行回归性分析发现，整个模型的P值0.01，表明此模型具有良好的可信度。此外，玉米浆、果糖、MnSO4因素的P值均0.05，表明其对AU-34产CGA具有显著影响，后续最陡爬坡试验以上述3个因素为基础。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T005表5Plackett-Burman试验结果试验号ABCDEFGHCGA/(mg/L)1-1-11-111-1-120.002-1111-1-1-1-130.223-1-1-11-111113.0041-1-1-11-11121.00511-1-1-11-1140.2761-111-111122.687-11-111-11133.028111-1-1-11-142.459-1-1-1-1-1-1-1-115.001011-1111-1-143.48111-1111-1-1-119.7112-111-1111-151.0010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T006表6Plackett-Burman试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型1 763.838220.4831.060.008 4A92.69192.6931.060.036 4B1 387.8311 387.8313.060.000 8C34.31134.31195.520.115 3D94.14194.144.830.035 7E50.39150.3913.260.076 1F44.20144.207.100.088 1G34.92134.926.230.113 3H25.38125.384.920.155 0注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著；下表同。2.5.5最陡爬坡试验结果（见表7）在Plackett-Burman试验的基础上设计最陡爬坡试验，结果发现，当果糖浓度30 g/L、玉米浆120 g/L、MnSO4 0.1 g/L时CGA产量最高。因此，设置此浓度为后续试验的最佳中心点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T007表7最陡爬坡试验结果试验号A/(g/L)B/(g/L)C/(g/L)CGA/(mg/L)110400.3015.12±1.48215600.2523.19±1.28320800.2030.35±2.594251000.1550.08±2.805301200.1081.81±1.836351400.0553.48±1.082.5.6Box-Behnken试验结果（见表8、表9、图7）以最陡爬坡试验为基础，利用Design Expert 8.0.6设计三因素三水平试验，CGA产量作为响应值，结果见表8，进行回归拟合得到二阶回归方程：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T008表8Box-Behnken试验结果试验号ABCCGA/(mg/L)1-11059.22±1.482000101.19±1.42311080.89±2.134-10169.59±1.23510176.09±0.966000103.56±2.39701165.38±1.40801099.57±1.5591-1062.56±1.231000096.95±1.48110-1-181.22±1.9812000101.24±2.361301-155.28±0.99140-1162.09±1.691510-179.56±1.2316-1-1068.93±2.1017-10-177.62±1.88Y=101.07+2.90A+1.33B-1.58C+7.01AB+1.14AC+5.32BC-8.28A2-24.18B2-17.78C2。由表9可知，模型的P值0.000 1，失拟项的P值0.05，表明该模型合理可行，预测AU-34的CGA产量具有可靠性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.T009表9Box-Behnken试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型4 152.869461.4337.150.000 1A70.48170.485.670.048 7B11.88111.880.960.360 6C13.97113.971.120.324 1AB196.591196.5915.830.005 3AC5.1815.180.420.539 0BC61.41161.414.940.061 5A2258.951258.9520.850.002 6B22 271.7512 271.75182.920.000 1C21 053.5511 053.5584.830.000 1残差86.94712.42失拟项63.09321.033.530.127 4纯误差23.8545.96总和4 239.8016响应面图的形状越接近椭圆，表明不同影响因素之间的交互作用越显著。由图7可知，AB之间的交互作用对CGA产量影响显著（P0.05），与表9结果一致。图7各因素交互作用对CGA产量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F7a1（a）玉米浆和MnSO4对CGA产量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F7a2（b）玉米浆和果糖对CGA产量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.014.F7a3（c）果糖和MnSO4对CGA产量的影响2.5.7模型预测与验证通过对所得模型分析，得到3种培养基成分的最佳浓度为果糖31.06 g/L、玉米浆124 g/L、MnSO4 0.1 g/L，预测CGA产量为101.42 mg/L，摇瓶验证试验测得CGA产量为102.55 mg/L，与预测值相近，表明该模型合理可行，具有参考价值。3讨论3.1诱变育种对于菌株产CGA的影响环境中分离得到的野生型菌株因具有产量低、耐受性低、稳定性低等一些不良特性，因而难以满足工业需求。而随机诱变是一种操作简单且对基因组未知的微生物具有显著优势的诱变方法，因此广泛应用于工业微生物改良。目前关于CGA的报道多集中于植物提取以及药理作用研究方面，对筛选得到的产CGA菌株诱变育种较少。本研究采用紫外结合ARTP复合诱变提高了野生菌株CGA的产量，其产量4.7 mg/L，为出发菌株的2.8倍，相比单一诱变效果明显，这可能是因为复合诱变具有协同效应[22]。因此，采用复合诱变是一种提高微生物产量的理想手段。3.2突变菌株AU-34培养基成分分析适宜发酵成分的探究不仅有助于菌株的生长及代谢产物产量增加，也有助于了解菌株特性[23]。本研究通过单因素优化试验，发现氮源是影响突变株AU-34产CGA的关键因素，以玉米浆作为氮源时，产量最高可达到99.85 mg/L，这可能是由于玉米浆作为玉米淀粉产生的副产物包含多种氨基酸和维生素，可作为菌株生长及其发酵的有效刺激因子促进菌株生长及产物合成[20]。此外，未添加氮源时，菌株生长差且不产生CGA，蛋白胨及酵母提取物的添加均促进了菌株产CGA，表明氮源对于菌株产CGA发挥至关重要的作用[24]。在此基础上，通过响应面优化试验获得显著影响AU-34合成CGA因素的最佳浓度，此时CGA产量达到102.55 mg/L，是未优化前产量的22倍。此时菌株产CGA的最大产量为优化枯草芽孢杆菌提高的CGA产量的2.7倍[12]，表明培养基优化对于提高菌株产次生代谢产物的能力具有较大潜力。4结论本研究针对N22合成CGA能力低的问题，采用紫外和ARTP复合诱变育种，筛选得到一株遗传稳定性良好的高产CGA菌株AU-34，对其发酵培养基优化，发现最佳培养基成分为果糖31.06 g/L、玉米浆124 g/L、MnSO4 0.10 g /L、L-Tyr 1.0 g/L、VB1 3.0 mg/L、CaCO3 3.0 g/L、Tween-80 0.05%。在该条件下，CGA产量达到102.55 mg/L，相比未优化前提高了约22倍。结果表明，复合诱变有助于提高菌株产CGA的能力；借助单因素优化，结合模型预测显著改善发酵培养基组分，提高了微生物生产CGA的产量。