自然界中，细胞作为生命活动的关键基础发挥至关重要的作用。精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）具有动物体内遗传信息向子代传递的特点[1]，在雄性动物的精子产生过程中起到至关重要的作用[2-4]。但由于SSCs在动物的睾丸细胞中占比较少，直接研究较为困难，因此需要对其生物学特征进行深入研究，通过有效的细胞分离手段分离睾丸中的SSCs，进一步纯化并体外培养，才能更加深入地对其相关机制进行研究[5]。自2003年对小鼠SSCs成功建立了一套体外培养系统后，现今对于动物SSCs的分离、纯化及体外培养方法日渐成熟，对猪[6-8]、牛[9-10]、羊[11-13]、马[14]等大动物的相关研究也在持续进行。随着后续技术的迅猛发展，一些依托于生物信息学、基因组学的新技术也逐渐应用于SSCs生物学特征的探究中。SSCs也因其具备自我更新的生物学特征成为基因编辑的新对象，且由其介导的动物模型也广泛应用于人类疾病的机制研究[15]，其对雄性动物生殖机制的研究也具有一定的促进作用。本文主要对SSCs的生物学特征、鉴定、分离、纯化、体外培养以及与SSCs研究中联合使用的新技术进行总结，以期为SSCs体外培养方法选择及其相关研究提供参考。1SSCs生物学特征1.1SSCs及分子学特征SSCs位于曲精细管基膜上，属于一类原始精原细胞，是精子发生过程中的关键细胞之一[16-17]。SSCs的“诞生”起源于精子、卵子结合生成的受精卵。当受精卵发育为三胚层的结构时，在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等一类功能蛋白的作用下生成原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC），之后在其自身的迁移作用驱使下到达生殖嵴，并被中肾细胞包围进而产生性原细胞，在雄性动物体内SRY等性控基因的作用下生成前精原细胞。研究者们根据不同精原细胞的生物学特征将其进行了进一步的分类，如小鼠精原细胞有A型、中间型、B型。从生物学特征出发，仍然保留干细胞潜能的未分化精原细胞为A0精原细胞，进一步分化为Asingle型、Apaired型和Aaligned型精原细胞[18]，高等灵长类动物分化为Adark型和Apale型。柴玮杰等[19]通过细胞培养发现，Asingle型精原细胞可能为真正的SSCs，这也是目前研究普遍认同的结论。但是否所有的Asingle型精原细胞均为SSCs尚未得到证实。Sun等[20]提出的SSCs层级假设认为Asingle型精原细胞根据其是否具有自我更新的生物学特征分为两部分，即长期具有和有限具有。因此在对SSCs的鉴定中，研究者们可根据SSCs的形态学特征，通过组织切片与H.E染色对其简单区分。SSCs形态学特征主要表现为：细胞呈圆形和椭圆形、体积大（相对于支持细胞和晚期精原细胞而言）、细胞核较大、核质比高、核仁呈网状、核内以常染色质为主[21]。但由于整个精子发生的过程中细胞的分化呈动态变化的复杂情况，单纯使用形态学的鉴定方法不够精准有效，因此常需在形态学鉴定的基础上进行更进一步的分子鉴定。分子鉴定以测定其细胞标记物表达情况进而达到对其细胞类型进行鉴定的目的，常用方法包括免疫学方法及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）。分子鉴定中细胞标记物至关重要，目前SSCs的标记物往往在精原细胞上均有表达，只是在SSCs上的表达量更高。由于SSCs具备干细胞的生物特征，也可选取干细胞的标记物进行鉴定。目前，已证实的SSCs标记物阳性表达的有UCHL1、GFRα1、DDX4、ZBTB16、Thy-1、CD9、CD24、FGFR3、LPPR3等。不同SSCs分子标记物的表达情况见表1[16]。宋连杰[14]利用了细胞免疫荧光染色以及实时荧光定量PCR等试验方法成功完成了对蒙古马SSCs的鉴定，试验证实了UCHL1相关细胞标记物在SSCs中的阳性表达。郑艳波等[22]采用免疫荧光技术鉴定了标记神经胶质细胞源神经营养因子胶质细胞源性神经营养因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）家族受体α1和VASA蛋白在SSCs细胞球中的高表达。但对于SSCs标记物的异质性研究目前仍不够成熟，各类细胞间差异表达基因的研究不够深入，应加大对细胞间的异质性的研究深度，利于鉴定准确性及精确性的提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.028.T001表1不同SSCs分子标记物的表达情况标记物名称精原细胞精母细胞早期精子晚期精子UCHL1（PARK5、PGP9.5、Uch-L1）88.410.43.56.0Thy-1（CD90）0.60.31.02.7CD9（BA2、MIC3、MRP-1、P24）74.17.33.013.1CD24（CD24A）7.20.622.553.4FGFR3（ACH、CD333、CEK2、JTK4）25.90.47.91.3LPPR3（FLJ11535、LPPR3、PRG-2）5.10.10.00.2注：数据来自The Human Protein Atlas数据库。nTPM1.2SSCs的自我更新机制及其微环境系统第一信使又称细胞外因子，与细胞受体（包括激素、神经递质、细胞因子、淋巴因子、生长因子及化学诱导剂）结合，发挥激活作用。细胞外因子在干细胞自我更新和分化过程中起到决定性的作用[23-25]。细胞外因子在其中的功能决定与之相关的信号通路被激活还是闭合，通过在转录水平上进行调节或在转录后进行调节，使SSCs不仅能够进行自我更新，还可实现恒定化，保持自身量的动态性，还能够定向性分化方式产生精母细胞。这一特点使精子发生过程能够循环往复，是精子发生的关键依据之一。SSCs自我更新的机制受多方面因素的影响[26]。一方面包括SSCs微环境中存在的相关因子（GDNF、FGF2、CSF1、EGF、Wnt5a、维生素A、ERM等），以配体的形式特异性与SSCs的表面特异性受体结合；另一方面包括SSCs本身具备的相关基因（GDNF调控依赖型、GDNF调控不依赖型）。一些关键的信号通路也对SSCs的自我更新机制起到联合调控作用。JAK/STAT信号通路是首个被确认对SSCs自我更新具备刺激与维系作用的细胞通路[27-28]。Kiger等[29]发现，Unpaired配体对通路激活起到至关重要的作用。Brawley等[30]则发现，对此通路进行阻断将导致SSCs自我更新速度下降，相反通过Upd配体进行激活则会使SSCs维持自我更新。而在SSCs自我更新的进程中，其衰老和消逝过程作为新发育周期的开端也起到关键作用。Kubota等[31]研究表明，SSCs的DNA复制时可能会受到破坏，导致DNA核苷酸序列永久性改变以及遗传造成线粒体缺陷，可能会影响到DNA的老化和消失。此外，相关的衰老基因的表达也会对其衰老消逝过程造成影响。SSCs自我更新的机制也依赖其自身复杂的微环境系统，主要构成包括支持细胞、血-睾屏障、血管网及其他体细胞。Kanatsu-Shinohara等[32]研究表明，血-睾屏障对生精上皮进行了分层，分为基底室及近腔室，SCN结构其核心是被精原细胞所占基底室。其中支持细胞充当非精子发生体细胞，虽仅占睾丸细胞总数量的3%，但却是唯一与精原细胞具有接触性关系的一类细胞，其发挥的分泌作用以及依靠其自身的紧密连接作用、黏附连接、缝隙连接而形成的血-睾屏障，对保持SSCs的自我更新起到了至关重要的作用。Kanatsu-Shinohara等[33]进一步对不育小鼠进行SSCs与支持细胞的共移入试验，结果表明支持细胞与SSCs的自我更新能力呈正相关的趋势。2SSCs的分离、纯化及体外培养2.1SSCs的初步分离（见表2）SSCs在成年雄性动物的睾丸细胞中占比较低，分离难度也比较高[34]，SSCs虽然具有自我更新的生物学特征，但随着动物年龄增长其数量也随之降低。由表2可知，SSCs的分离时间根据不同的试验动物而有所不同，一般会在动物的青春期前进行分离。Meistrich等[35]在1981年首次采用胰蛋白酶结合脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）的“一步分离法”，在小鼠睾丸中分离SSCs，但这一方法分离得到的SSCs存在浓度较低的缺点。目前常采用酶消化法和机械分离法作为SSCs的分离方法[36]。酶消化法常用酶是胰蛋白酶、胶原酶、DNaseⅠ等，该方法对细胞损伤较小，得到的细胞质量较好，但需要研究人员在实际操作中精准把控酶消化时间，同时也需要根据质量标准严格选控所使用的酶的质量。机械分离法方便简单，但易造成细胞损伤。因此结合酶消化法与机械分离法是目前最常见的SSCs的分离方法，可得到质量、纯度均较好的细胞，主要步骤包括：采用机械分离方法对动物睾丸组织进行初步分离，再使用消化酶分离。SSCs经过上述分离过程后，即生成最初的单细胞悬液，这是后续体外培养是否成功的关键。张茂等[37]对猪的SSCs进行初步分离时，先将其睾丸组织进行机械性处理，再使用胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶进行水解，最后在培养液中培养，完成分离。结合酶消化法与机械分离法进一步有效提高了SSCs分离的完成度且完成质量较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.028.T002表2不同动物SSCs分离最佳时期动物最佳分离时期文献来源小鼠5～8 dKhanehzad等[38]、Ohbo等[39]、Nagano等[40]大鼠9～10 dLaw等[41]、Hamra等[42]猪25 d左右张立苹等[43]、Zhao等[44]山羊1～4月龄Gul等[45]、Heidari等[46]、Bahadorani等[47]、Ren等[48]牛3～7月龄Aponte等[49]、Aponte等[50]、Mahla等[51]水牛3～14月龄Kala等[52]、Rafeeqi等[53]、Yu等[54]蒙古马9～12月龄宋连杰[14]2.2SSCs的纯化对SSCs的初步分离完成后，进一步进行SSCs纯化步骤，可获得质量更高、数量更多的SSCs。纯化方法包括差速贴壁法、密度梯度法、磁珠标记细胞分选法和流式细胞术等。这些方法各具特点，在实际应用中通常采取多种方法结合才能保证纯化的质量，且应用不同纯化方法时也需要根据试验的实际情况进行相应改进以达到更理想的试验效果。孔群芳等[55]在纯化山羊SSCs时对纯化大鼠SSCs时所使用的差异贴壁法进行了改进，将细胞悬液接种至层黏连蛋白涂层的培养皿前，依次接种至明胶、大鼠鼠尾胶原培养皿，有利于山羊SSCs的纯化。2.2.1差速贴壁法与密度梯度法差速贴壁法于1981年被提出[56]，该方法利用不同细胞对多聚赖氨酸黏附性的差异性这一特点达到对细胞进行分离纯化的目的。陈庭锋等[7]采用差速贴壁法成功获得具备多样分化性的猪SSCs。但由于差速贴壁法在分离纯化中具备操作速度快、简单等优点及特点，其常在干细胞、嗅黏膜嗅鞘细胞、内皮祖细胞、SSCs、肌源性干细胞等多种细胞领域的分离纯化中被使用，并适合处理大量样品。在鼠、牛、猪等动物的SSCs分离纯化过程中使用差速贴壁法同样可以提高细胞纯度。凡志国[57]采用连续、多次性的差速贴壁法，成功在大鼠睾丸中获得70%以上纯度的SSCs。郑鹏等[58]在新生牛的睾丸中采用差速贴壁法获得72%纯度的SSCs。Zheng等[59]使用差速贴壁法将猪睾丸中提取的SSCs纯度提高至90%。但是由于差速贴壁法对一些黏附性差异不明显的细胞分离纯化的异质性较差，纯化后常掺杂其他成纤维细胞，因而应进一步对方法进行优化或后续利用其他纯化方法加以辅助。Percoll密度梯度法属于密度梯度法，使用聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone，PVP）硅胶颗粒混悬液Percoll分层液[60]，视细胞密度而定将细胞分离，从而达到细胞纯化之目的。密度梯度法适用范围广，不仅能够分离细胞，还可以分离DNA和mRNA，常与差速贴壁法结合应用，可增强SSCs的分离纯化效果。王永彬等[61]联合使用差异贴壁法和Percoll密度梯度法对小鼠SSCs进行纯化，纯化度达64.42%。Shi等[62]使用差异贴壁法后，使用Percoll密度梯度法对19%~27%的密度梯度处进行了猪SSCs的收集且阳性率较高。上述研究联合使用差速贴壁法与密度梯度法后均进一步提高了SSCs的纯化率并得到了纯化度较高的细胞，因此将两种方法联合使用其可行性较高。2.2.2磁珠标记细胞分选法磁珠标记细胞分选法是基于磁珠上的官能团，直接或间接地与细胞表面配体相互识别作用后，进行特异性捕获分离。其步骤为MACS磁珠标记细胞，样品加入分离器上的MACS分选柱，标记细胞留在柱内，未标记细胞先行流出，移出分选器中的分选柱，洗脱标记细胞。研究中常使用免疫磁珠分选法对SSCs进行纯化，其原理是通过带有抗体的免疫磁珠的磁性与细胞抗原的特异性相匹配而达到对细胞分选进而纯化的目的。Conrad等[63]使用整联蛋白（整合素）α6纯化出高达90%纯度的人SSCs。Kubota等[64]使用胸腺细胞抗原-1（thymus cell antigen-1，THY-1）纯化出高纯度的SSCs，纯度提高30%。上述研究均是在经过前期摸索及文献查询的阶段后，在磁珠标记细胞分选法中使用特异性的抗体，对SSCs分离纯化度的提高起显著作用。2.2.3流式细胞术流式细胞术作为取得较高纯度的SSCs分离、纯化方式之一，融合了流体力学、激光、电子物理、光电丈量、计算机、荧光化学及单克隆抗体等技术，能够在其特殊的液体系统中完成对单个细胞、细胞器生物特征进行快速鉴定，进而分类收集特定的细胞、细胞器。流式细胞术在SSCs的分离纯化中依托于免疫荧光抗体与细胞结合，再通过流式细胞仪进行信号转换和收集。Hamra等[42]采用流式细胞仪富集到纯度为90%的SSCs。Kubota等[64]采用流式细胞仪富集高达6倍的SSCs。刘建兵等[65]在使用Percoll密度梯度法后通过流式细胞仪得到纯度为80.4%的SSCs。综上所述，这一方法在具有速度快、精确性高、通量大等优势的基础上可以使SSCs纯度也较高[66-67]。2.3SSCs的体外培养睾丸作为雄性动物繁殖活动的重要器官，其在整个生命进程中发挥至关重要的作用[68]。而曲细精管作为睾丸精子发生的重要场所，是SSCs发育、分化的主要场所。SSCs的体外培养主要在于体外模拟曲细精管内部环境，进而达到体外培养的目的。1999年，Shinohara等[69]对小鼠SSCs进行了体外培养，但由于当时并无体外培养经验且无血清及饲养层。2008年，Kanatsu-Shinohara等[70]对Shinohara等[69]的方法进行了进一步改进，在特殊培养皿（层黏连蛋白涂层）中添加血清及生长因子，构建出一套完整的小鼠SSCs体外培养的体系，也为今后的研究奠定了基础。随着研究不断深入，发现基础培养基、适宜的温度、饲养层（滋养层）细胞、血清、生长因子和添加剂等均是影响SSCs体外培养的关键条件（见表3），根据不同动物进行相应选择，进而达到对SSCs进行长期体外培养的目的。张仙玉等[71]通过使用不同的饲养层、培养基，添加不同的生长因子观察小鼠体外SSCs的培养情况，进而筛选出最佳的SSCs体外培养模式，结果显示，饲养层为：小鼠胎儿成纤维细胞（mEF）、培养基（StemPro-34），生长因子：胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、白血病抑制因子（LIF）、表皮生长因子（EGF）、bFGF、IGF1。目前对于鼠SSCs的体外培养由于研究较多日趋成熟，可达到超过2个月的培养时间[72]，且不限于传统的培养方法。Lee等[73]利用三维微环境系统，通过对小鼠成纤维细胞（STO）进行旁分泌信号传导，成功促进了SSCs的体外培养。但由于其他大动物的研究尚不完备，培养时间往往无法超过2个月[74-76]，应加强对牛、羊、马等大动物的研究探索。宋连杰[14]对蒙古马睾丸SSCs采用机械分离法、酶消化法和差速贴壁法进行了分离纯化，采用支持细胞作为饲养层对SSCs进行了体外培养，最后通过免疫荧光染色等方法对结果进行了验证，为今后蒙古马SSCs的体外培养奠定了一定的基础。Valdivia等[77]分别在两种不同的培养基（DMEM、StemPro）中对羊驼的SSCs进行了体外培养，通过流式细胞仪的结果进行对比，发现两种培养基均适用于羊驼SSCs的体外培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.028.T003表3SSCs体外培养的不同影响因素及其选择方案影响因素动物选择方案文献来源培养基鼠StemPro-34SFMKanatsu-Shinohara等[78]鼠、羊驼DMEM/F12Hamra等[66]、Valdivia等[77]牛MEMIzadyar等[79]羊驼StemProValdivia等[77]饲养层鼠小鼠成纤维细胞（STO）Lee等[73]鼠小鼠胎儿成纤维细胞（mEF）张仙玉等[71]鼠间充质干细胞（MSCs）Kadam等[80]猪、马睾丸支持细胞Zhang等[81]、宋连杰[14]鼠无饲养层Kanatsu-Shinohara等[82]血清牛胎牛血清Pirnia等[83]鼠无血清Kanatsu-Shinohara等[82]生长因子鼠表皮生长因子（EGF）凡志国[57]鼠、羊胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）Shinohara等[69]、Binsila等[84]鼠、鸡白血病抑制因子（LIF）Khaleel等[85]、Rasouli-Gharehsaghal等[86]3SSCs研究中的新技术应用3.1单细胞转录组测序单细胞转录组测序技术（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一种高通量的单个细胞层面的mRNA测序技术，以单细胞和高通量为主要特征，解决了目前细胞分子机制研究普遍存在的细胞异质性、细胞量小、无法常规高通量测序的难题。随着scRNA-seq技术不断发展，动物繁殖研究中已有越来越多的研究人员引入了该技术。SSCs分化成精原细胞的过程中将会经历不同的阶段，这一过程的连续使得每一种细胞具备了独特的异质性。scRNA-seq可对这一过程中的每一种细胞进行深度测序，从转录组水平对每一种细胞进行分类，揭示SSCs的异质性。Guo等[87]通过对睾丸细胞悬液进行转录组测序，重新定义了两种可能为静止的SSCs，即“状态0”和“状态1”。高源[88]通过采集性成熟前后两个阶段安格斯公牛睾丸的细胞，利用scRNA-seq鉴定了12个细胞类群（9种体细胞和3种生殖细胞），又通过聚类分析重点将睾丸生殖细胞划定为13个类群，与后续特异基因的表达研究结合。同时scRNA-seq的拟时序分析功能也可通过可视化程序展现SSCs分化的动态过程，从而对SSCs分化关键节点的分子特征变化进行相关揭示。Hermann等[89]利用拟时序轨迹分析，发现SSCs的典型起点基因（GFRA1、ID4、ETV5、NANOS2、PAX7、TS-PAN8、RHOX10、ZBTB16），对SSCs鉴定具有一定指导作用。但是这一技术也具有测序费用昂贵、重复性差及大动物应用中经验不足等局限性，需要进一步完善测序方法，减少测序费用。3.2基因编辑技术基因编辑技术是一种能够较精确地对生物体基因组特定目标基因进行修饰的新兴基因工程技术，广泛应用于建立研究人类疾病的动物模型。而由于SSCs具备自我更新的干细胞特征，其作为基因编辑的对象可不断产生具备修饰基因的精子，进而成为建立人类疾病动物模型的有利途径。而作为基因编辑的“利器”——第三代基因编辑技术CRISPR/Cas9，克服传统方法的缺点（周期长、效率低、应用窄等），以其操作简单、成本低、效率高的优点得到广泛应用。Chapman等[90]对小鼠SSCs的Epsti1和Erbb3基因，使用CRISPR/Cas9成功进行了突变并产生了基因敲除的后代。Niu等[91]也成功使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对食蟹猴SSCs的多个基因进行了突变。Li等[92]利用CRISPR-Cas9进行基因编辑树鼩SSCs，基因修饰后的树鼩SSCs移植到经白消安处理的雄性受体树鼩睾丸内，可产生基因修饰精子，通过自然交配从而获得基因修饰子代树鼩，这一研究突破了目前树鼩研究基因操作技术匮乏的瓶颈难题，为树鼩这一新型试验动物广泛推广奠定了基础。该技术的不断成熟以及与SSCs生物特征研究的结合将会对雄性动物生殖疾病的治疗起到指导作用，同时也可以从基因层面探究雄性动物生殖的相关机制，进而提高生产性能。4展望SSCs作为动物睾丸精子生成过程中的关键细胞之一，可通过其自我更新机制以及其微环境系统，为新精子的产生提供必不可少的保障。使用机械法与酶消法结合对SSCs进行分离，再通过后续规范的纯化、体外培养过程，进而得到质量较高的SSCs，对SSCs的后续研究奠定了基础。目前关于小鼠、大鼠的体外培养体系已经基本成熟，但对猪、牛、羊、马等大动物的研究尚不完备，需要不断探索。随着第二代测序技术、第三代测序技术以及第三代基因编辑技术的发展和成熟，对SSCs的研究手段和应用范围在逐渐呈深入化、广阔化的趋势，有关其异质性、分子特征的研究不足这一缺口逐渐被填补。随着相关研究深入，以SSCs作为介质的动物模型研究也会对进一步解析一些雄性疾病的相关机制提供帮助。