蛋白同化激素是一类拟雄性激素的人工合成的甾体激素，能够促进细胞生长与分化，具有较强的蛋白同化作用[1-2]。但是残留在畜禽体内的蛋白同化激素会通过食物链转移到人体内，给人体造成危害[3-4]。目前，常见的蛋白同化激素根据结构分为5类，GB/T 22260—2008[5]对饲料中的甲基睾丸酮进行了测定，农业农村部公告1068-3—2008[6]对配合饲料中的蛋白同化激素进行了测定，但是两个标准检测的饲料种类均有限，且检测的蛋白同化激素只有4类。研究表明，现在市面上的预混合饲料种类多，且存在非法添加情况[7]。因此，有必要单独建立预混合饲料中蛋白同化激素的检测方法。目前，关于蛋白同化激素检测的研究多集中在血清[8-9]、尿液[10-11]中，检测方法多用液相色谱-串联质谱法[12-14]、气相色谱-串联质谱法[15-17]等。但关于预混合饲料中的蛋白同化激素研究较少。预混合饲料种类多，基质复杂，基质效应明显，使用基质匹配方法进行检测，试验烦琐不易推广。本文拟选择空白预混合饲料进行研究，选择较为常见的5大类蛋白同化激素（共11种）进行研究，采用内标法辅助定量，以期为预混合饲料中非法添加蛋白同化激素监管提供技术参考。1材料与方法1.1试剂与材料乙腈、甲醇、甲酸均为色谱级，购自Merck公司。勃地龙、诺龙、美雄酮、睾酮、脱氢异雄酮、司坦唑醇、甲基睾丸酮、雄烯二酮、黄体酮、醋酸美伦孕酮、丙酸诺龙及11种同位素内标，纯度≥93.0%购自Dr. Ehrenstorfer公司。乙二胺-N-丙基硅烷，粒径40 μm，购自Agilent Technologies公司。50%乙腈溶液：准确量取50 mL乙腈，纯水稀释并定容至100 mL。分别准确称取11种蛋白同化激素对照品10.0 mg，使用乙腈溶解并定容至100 mL，得到100 mg/L的标准储备液。准确量取各储备液1 mL，使用乙腈稀释，定容至100 mL，得到1 mg/L的外标使用液。分别准确称取11种蛋白同化激素同位素内标10.0 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL，得到100 mg/L的内标储备液。准确量取各内标储备液1 mL，用乙腈稀释并定容至100 mL，得到1 mg/L的内标使用液。准确量取适量外标使用液和内标使用液，用50%乙腈溶液配制标准工作液，外标质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50.0、100 μg/L，内标质量浓度为10 μg/L。1.2主要仪器设备H Class超高效液相色谱、XEVO-TQ-MS三重四极杆质谱购自Waters公司，高速冷冻离心机购自Beckman公司，高速漩涡振荡器购自Targin公司，万分之一电子天平购自Mteeler Toledo公司，Milli-Q超纯水系统购自Millipore公司。1.3试验方法1.3.1样品制备称取试样1.00 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，准确加入100 μL内标溶液，20 mL乙腈，1 500 r/min振荡提取20 min，9 000 r/min离心5 min，取3 mL至50 mL离心管中，加入100 mg N-丙基乙二胺（PSA）粉，涡旋1 min，9 000 r/min离心5 min，准确移取2 mL至10 mL离心管中，于50 ℃下用氮气吹干，使用1 mL 50%乙腈溶液溶解，涡旋混匀，经0.22 μm滤膜过滤，上机测定。1.3.2仪器条件1.3.2.1超高效液相色谱条件色谱柱：Phenomenex C18柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm），柱温35 ℃，进样体积10 μL，流动相A为0.01%甲酸溶液，流动相B为乙腈。流动相洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.T001表1流动相洗脱程序时间/min流动相A/%流动相B/%流速/(mL/min)060400.32.0060400.35.0001000.36.5001000.36.6060400.37.5060400.31.3.2.2质谱条件电喷雾离子源（ESI）采用正模式扫描，载气800 L/min，反吹气50 L/min，雾化器温度500 ℃，电离电压3.5 kV，源温150 ℃。化合物保留时间及质谱参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.T002表2化合物保留时间及质谱参数序号化合物保留时间/min母离子子离子碰撞能量/V孔电压/V1勃地龙2.42286.9120.9*/134.922/14202诺龙2.58275.0108.9*/239.028/16303睾酮3.08289.096.9*/108.522/24324美雄酮2.97300.9120.9*/92.924/32205甲基睾酮3.45302.9109.0*/96.928/26326醋酸美伦孕酮4.42397.1337.1*/294.515/20257脱氢异雄酮3.41288.9253.0*/212.910/16128丙酸诺龙4.98330.9257.0*/56.912/22269黄体酮4.33314.996.9*/108.922/283010司坦唑醇3.35329.080.9*/94.944/404011雄烯二酮3.48286.996.9*/108.920/2624续表2　化合物保留时间及质谱参数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.T003序号化合物保留时间/min母离子子离子碰撞能量/V孔电压/V12勃地龙-D32.42290.2121.1262013诺龙-D32.58278.2109.0303214睾酮-D33.08292.297.0223015美雄酮-D32.97304.5286.2102016甲基睾酮-D33.45306.297.0283217醋酸美伦孕酮-D34.42400.2337.1122418脱氢异雄酮-D23.41291.5273.2101519丙酸诺龙-D34.98334.5257.2152520黄体酮-D94.33324.3100.0243021司坦唑醇-D33.3533280.9442022雄烯二酮-D73.48294.2113.02630注：“*”表示定量离子对。1.3.3标准曲线绘制、方法的检出限和定量限采用50%乙腈溶液配制标准曲线，质量浓度为1、5、10、50、100 μg/L，以目标分析物的定量离子峰面积和对应的同位素内标峰面积比值为纵坐标，目标物浓度为横坐标，绘制标准曲线。选择向空白基质中添加一定浓度的蛋白质同化激素对照品，按照本标准进行试验。依据信号与噪声比例（S/N），即S/N≥3为检出限，S/N≥10为定量限。1.3.4方法回收率及精密度以空白饲料基质样品进行低、中、高3个浓度的加标回收试验，每个水平重复测定5次，计算加标回收率及精密度。1.3.5基质效应评价乙腈作为提取剂在提取目标物的同时，还会提取到非常多的杂质，这些杂质可能会对目标物的检测造成影响，因此，选择向空白预混合饲料提取后的溶液中添加100 μg/L的蛋白同化激素考察基质效应（ME）。ME=基质溶液中分析物峰面积/纯溶剂中分析物峰面积×100%(1)2结果与分析2.1仪器条件优化结果根据相关资料[18-21]，蛋白同化激素在ESI正离子化模式下响应高，因此采用针泵进样模式将22种目标分析物单标溶液以20 μL/min的流速进入质谱仪，在50~1 000 荷质比范围内做一级质谱全扫描，得到各目标物生成[M+H]的母离子，依次进行子离子扫描，各目标物选择最优的2个特征离子作为定量离子和定性离子，优化各目标分析物的孔电压和碰撞能量，在MRM模式下优化鞘气流速、辅助气、吹扫气、离子传输温度等质谱参数。选择C18柱作为试验用色谱柱，考察了在甲醇-水、乙腈-水两种流动相体系下目标分析物的色谱峰形和保留时间。结果显示，当流动相中有机相为甲醇时，部分药物峰型差，响应低，可能是因为部分药物在甲醇中溶解性差。而当有机相为乙腈时，药物响应及峰型相对较好。因此，试验选用乙腈-水作为流动相。本研究组的前期研究结果表明，向流动相中加入少量酸可以提高正离子化效率。因此，向流动相体系中加入0.01%、0.05%、0.10%甲酸，比较不同甲酸添加量对色谱分离的影响，结果显示，当流动相体系中含有酸时对丙酸诺龙影响最大，对其他药物影响不显著，当流动相含0.01%甲酸时，丙酸诺龙的响应显著提高。因此，选择0.01%甲酸-乙腈-水体系作为流动相进行梯度洗脱。选择0.01%甲酸-乙腈-水体系作为流动相，探究Waters ACQUITY BEH C18（100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm）色谱柱、Phenomenex C18（100 mm × 2.1 mm, 2.6 μm）色谱柱和Agilent SB-18（100 mm × 2.1 mm, 1.8 μm）色谱柱对目标物的分离度和灵敏度的不同影响。结果显示，在同一流动相及梯度洗脱条件下，不同色谱柱间差异不明显，目标药物在Phenomenex C18柱上响应更高，峰型更好。因此，选择Phenomenex C18对11种蛋白同化激素进行分离。11种蛋白同化激素的多反应监测色谱结果见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.F001图111种蛋白同化激素的多反应监测色谱结果2.2样品预处理条件优化结果2.2.1提取条件的选择根据文献[22]至文献[23]，现有标准和文献采用甲醇-水、乙酸乙酯对蛋白同化激素提取，因此，本试验考察30%甲醇溶液，30%乙腈溶液、甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为提取剂，提取溶剂对化合物回收率的影响见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.F002图2提取溶剂对化合物回收率的影响（n=3）由图2可知，当提取剂为30%甲醇溶液和30%乙腈溶液时，11种蛋白同化激素的提取效率低，可能是因为甾体激素均为脂溶性激素，在水中溶解性差。当提取剂为甲醇时，部分药物提取效率差，可能是因为这些药物不溶于甲醇，或者在甲醇中溶解性差导致的。当提取剂为乙腈和乙酸乙酯时，11种药物提取效率较好。因此，考虑试验操作的简便性，选择乙腈作为提取剂。2.2.2净化条件的选择根据相关资料[24-26]，现有净化条件大多采用固相萃取和QuEChERS方法，因此试验选择考察固相萃取（HLB、PRIME HLB和MCX）和QuEChERS（C18粉、PSA粉、酸性氧化铝粉末）考察净化条件，结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.F003图3净化条件对化合物回收率的影响（n=3）由图3可知，当选择SPE固相萃取小柱作为净化条件时，部分药物回收率差，可能是因为选择HLB和PRIME HLB时，部分药物在小柱上保留好，难以洗脱。选择MCX小柱时，药物在小柱上保留差；选择C18粉和酸性Al2O3粉时，其对目标药物吸附性强；当选择QuEChERS方法作为净化条件，MgSO4、NaCl和PSA粉混用时，会带入新的杂质干扰；当单独选择PSA粉时，11种蛋白同化激素的回收率较好，且能有效减少杂质对丙酸诺龙的干扰。因此，试验选择0.1 g PSA粉作为净化条件。2.3方法学验证结果2.3.111种蛋白同化激素的线性方程、线性范围、方法检出限和方法定量限 （见表3）由表3可知，11种目标分析物在1~100 μg/L线性范围内线性关系良好（R0.993 9）。本方法中甲基睾酮、司坦唑醇和醋酸美伦孕酮的检出限为5 μg/kg，其余8种目标物的检出限为20 μg/kg；甲基睾酮、司坦唑醇和醋酸美伦孕酮的定量限为10 μg/kg，其余8种目标物的定量限为50 μg/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.T004表311种蛋白同化激素的线性方程、线性范围、方法检出限和方法定量限项目线性方程相关系数方法检出限/(μg/L)方法定量限/(μg/L)线性范围/(μg/L)勃地龙y=0.530 9x+0.041 90.999 020501~100诺龙y=1.021 2x+0.054 80.999 620501~100睾酮y=0.877 3x+0.055 00.999 520501~100美雄酮y=1.708 8x+0.116 40.999 720501~100甲基睾酮y=0.835 1x+0.080 20.999 45101~100醋酸美伦孕酮y=1.012 4x+0.074 30.999 35101~100脱氢异雄酮y=0.654 4x+0.159 60.993 920501~100丙酸诺龙y=0.472 9x+0.027 90.999 520501~100黄体酮y=0.764 4x+0.120 00.998 120501~100司坦唑醇y=0.824 7x+0.063 80.999 25101~100雄烯二酮y=1.905 8x-0.050 60.999 920501~1002.3.211种蛋白同化激素在不同浓度加标水平的加标回收率和相对标准偏差（见表4）由表4可知，11种蛋白同化激素加标回收率为85.38%~115.72%，RSD为0.5%~14.8%，方法准确度和精密度满足要求，适用于预混料中11种蛋白同化激素测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.T005表411种蛋白同化激素在不同浓度加标水平的加标回收率和相对标准偏差（n=6）项目添加浓度/(μg/kg)加标回收率/%相对标准偏差/%勃地龙50~40 000093.01~104.360.8~3.9诺龙50~40 000095.95~106.761.0~3.8睾酮50~40 000093.30~105.280.5~5.5美雄酮50~40 000093.96~106.180.8~7.7甲基睾酮10~40 000092.23~107.480.5~6.0醋酸美伦孕酮10~40 000092.73~103.440.8~3.2脱氢异雄酮50~40 000087.60~109.921.4~14.8丙酸诺龙50~40 000096.42~106.880.6~4.8黄体酮50~40 000087.26~115.720.9~2.6司坦唑醇10~40 000086.15~110.081.4~11.5雄烯二酮50~40 000085.38~102.161.4~5.32.4基质效应（见图4）由图4可知，在不同基质中11种蛋白同化激素的ME值为56.5%~97.8%，大部分药物显示出基质抑制，考虑预混料基质复杂，因此试验选择内标法辅助定量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.023.F004图4基质效应3结论研究采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了预混料中11种蛋白同化激素的测定方法，填补了预混料中蛋白同化激素检测的空白。本方法采用乙腈提取，PSA净化，操作简单，采用内标法辅助定量，保证了检测方法的结果准确、重现性好，适用于测定预混料中11种蛋白同化激素含量，以期为预混合饲料中非法添加蛋白同化激素监管提供技术参考。