油脂能够为动物的生长提供必需脂肪酸，是动物生长的能量来源，对动物的生长具有重要作用。畜禽饲料中添加一定水平的油脂替代等能值的糖类和蛋白质，能提高饲料的代谢能，降低消化过程中能量消耗和热增耗，增加饲料的净能[1]。油脂在生产、运输、储存过程中能够与空气中的氧、日光及微生物与酶作用产生具有高度活性的中间产物过氧化物，继续分解生成具有挥发性的醛类、酮类和低分子的脂肪酸等，使油脂散发出特殊臭味和刺激性气味，降低油脂品质，严重时甚至不能使用[2-3]。过氧化值是评价油脂品质的重要指标，能够反映油脂氧化初期的变质情况[4-6]。通常以1 kg样品中活性氧的毫摩尔数表示，也可用油脂过氧化物从碘化钾中析出碘占试样的百分比表示。目前，测定食品和香料中过氧化值的方法已比较成熟[7-10]，现行的标准有动植物油脂过氧化值的测定-指示剂滴定法（ISO 3960—2017）[11]、动植物油脂中过氧化值的测定-电位滴定法（ISO 27107—2008）[12]、乳脂肪中过氧化值的测定（ISO 3976—2006）[13]、食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定（GB 5009.227—2016）[14]、香料过氧化值的测定（GB/T 33918—2017）[15]等。但对饲料原料油脂中过氧化值测定方法的研究较少[16-17]。饲料原料用油脂种类繁多，且多为粗油，杂质多、颜色深，与食品基质存在一定差异，部分油脂无法直接参照现行标准进行检测。电位滴定法是根据滴定过程中电位的突跃确定滴定终点。由于滴定过程中受样品的杂质、颜色等干扰小，避免了化学滴定法（指示剂滴定法）中由于计量点和滴定终点不一致导致的滴定误差，更适用于有色或浑浊样品的检测[18]。本试验针对饲料用油脂的特殊性，对饲料原料油脂过氧化值的检测方法开展研究，制定了电位滴定法测定饲料原料油脂过氧化值的方法，为保障我国饲料安全及质量提供参考。1材料与方法1.1主要仪器与试剂XP205电子天平（瑞士METTLER公司），916 Ti-Touch电位滴定仪（瑞士Metrohm公司），DL50电位滴定仪（瑞士METTLER公司），ZDJ-4B电位滴定仪（上海雷磁公司），FD115电热恒温干燥箱（德国Binder公司），KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器公司），R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。石油醚（沸程为30~60 ℃）、碘化钾饱和溶液、无水硫酸钠、异辛烷-冰乙酸混合溶液（体积比2∶3），均为分析纯。硫代硫酸钠标准滴定溶液（0.01 mo1/L）按GB/T 601—2016配制和标定稀释。1.2样品来源依据饲料原料目录中过氧化值作为强制性要求的产品类型及部分饲料原料的特点，试验选择谷物及其加工产品（玉米油、米糠油、玉米糖渣）、油料籽实及其加工产品（菜籽油、大豆油、大豆磷脂油、大豆磷脂油粉）、籽实、果实类产品及其加工产品（辣椒籽油）、乳制品及其副产品（黄油、稀奶油）、陆生动物及其副产品（猪油、鸡油）、水生生物及其副产品（鱼油）、其他油脂粉（乳化均衡油粉）作为代表性样品。饲料原料油脂均购自浙江良海粮油有限公司或超市。1.3样品制备动植物油脂（玉米油、米糠油、菜籽油、大豆油、大豆磷脂油、辣椒籽油、猪油、鸡油和鱼油）：油脂样品常温下呈液态，取混合均匀的样品30 mL，加入10 g无水硫酸钠去除水分，静置，取上层油脂为待测试样；油脂样品常温下呈固态，将油脂样品置于40 ℃预热后的电热恒温干燥箱中加热熔化，加入适量无水硫酸钠，反复振摇后静置，取上层油脂为待测试样。油脂制品及其副产品（玉米糖渣、大豆磷脂油粉和乳化均衡油粉，下文简称油脂制品）：取代表性的样品，混匀后进行油脂的提取。黄油：取代表性样品，置于40 ℃预热后的电热恒温干燥箱中加热熔化，混匀，进行油脂提取。稀奶油：取代表性样品，混匀，进行油脂提取。1.4油脂提取动植物油脂：按1.3方法去除水分后直接进行试样称量。油脂制品：取有代表性的试样约100 g，置于广口瓶中，加入3~5倍样品体积的石油醚，摇匀，加入20 g无水硫酸钠，充分混合后密闭，静置浸提12 h，石油醚层液体8 000 r/min离心5 min，于旋转蒸发仪中40 ℃以下蒸干，残留物即为待测试样。黄油：取有代表性的试样约100 g，加入400 mL石油醚，搅拌溶解，加入20 g无水硫酸钠，充分搅拌，静置，收集上清液于圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪中40 ℃以下温度蒸干，残留物即为待测试样。稀奶油：取有代表性的试样约100 g于磨口瓶中，加入400 mL石油醚，使用玻璃棒充分搅拌溶解试样，加20 g无水硫酸钠，使用玻璃棒搅拌约10 min，盖上瓶塞后静置约12 h，收集上清液于圆底烧瓶中，再加入200 mL石油醚，玻璃棒搅拌约10 min，静置至上清液澄清，收集上清液，合并2次上清液，于旋转蒸发仪中40 ℃以下蒸干，残留物即为待测试样。1.5试验方法按照表1称取样品，置于滴定杯中（若检测后发现该试样的过氧化值范围与表1对应的称样量不符，再次按照表1，调整称样量后重新测定）。在滴定杯中加入50 mL异辛烷-冰乙酸混合溶液，振摇或超声使样品完全溶解。向滴定杯中准确加入0.5 mL碘化钾饱和溶液，搅拌反应（60±1）s，向滴定杯中加入50 mL水进行电位测定，记录滴定终点消耗的标准滴定溶液体积。采用等量滴定模式按上述步骤，不添加样品进行空白试验。空白试验消耗0.01 mo1/L硫代硫酸钠溶液体积不得超过0.1 mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T001表1建议称样量过氧化值范围/(mmol/kg)称样量/g标准滴定溶液浓度/(mol/L)55.00.01≥5~255.0~2.0≥25~451.01.6结果计算过氧化值的计算公式为：ω1=(V-V0)×c2×m×1 000 (1)式中：ω1为过氧化值（mmol/kg）；V为试样油脂消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积（mL）；V0为空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积（mL）；c为硫代硫酸钠标准滴定溶液浓度（mol/L）；m为试样质量（g）；2为硫代硫酸钠与碘反应的摩尔换算系数。2结果与分析2.1样品制备和提取方法的确定2.1.1动植物油脂提取方法的确定动植物油脂样品，颜色较深，样品静置后会有大量沉淀。将样品在50 ℃恒温干燥箱内过滤或用热过滤漏斗过滤后称样[19-20]。试验发现，采用热过滤或热过滤漏斗过滤样品损耗大，耗时长，若样品中杂质过多或呈膏状，短时间内无法通过漏斗流出，操作不方便。改进的方法是取混合均匀样品30 mL，加入10 g无水硫酸钠去除样品中水分，静置，取上层油脂直接测定。热过滤处理和直接除水测定样品的过氧化值见表2。由表2可知，热过滤测定样品中过氧化值均高于直接除水测定的过氧化值。因此，试验所用动植物油脂可直接去除水分摇匀后取样。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T002表2热过滤处理和直接除水测定样品的过氧化值项目热过滤处理/(mmol/kg)热过滤耗时/(30 mL/min)直接除水测定/(mmol/kg)相对偏差/%玉米油2.24401.859.5米糠油4.76704.334.7菜籽油2.95452.518.1大豆油1.57401.309.4大豆磷脂油无法过滤———辣椒籽油3.82603.425.5猪油2.46902.244.7鸡油2.66902.326.8鱼油3.19902.786.7注：“—”表示无此数据；表5、表6与此同。2.1.2油脂制品提取方法的确定油脂制品本身不能溶于异辛烷-冰乙酸混合溶液，需提取样品中的油脂测定。试验分别采用浸提法（取样品适量，加3倍体积石油醚及20~30 g无水硫酸钠密闭浸泡12 h，充分搅拌混合吸附脱水并静置沉淀，离心取上清液低于40 ℃减压蒸干）和振荡法（取样品适量，加3倍体积石油醚及20~30 g无水硫酸钠于振荡器上振荡1 h以上，离心取上清液低于40 ℃减压蒸干）进行提取试验。浸提法和振荡法的比较结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T003表3浸提法和振荡法比较结果项目提取方法油脂收率/%过氧化值/(mmol/kg)大豆磷脂油粉浸提法38.002.46振荡法38.102.91玉米糖渣浸提法9.807.18振荡法11.607.47乳化均衡油粉浸提法28.100.85振荡法32.701.03由表3可知，油脂收率无明显差异，玉米糖渣和乳化均衡油粉样品，浸提法的油脂收率低于振荡法。3类样品采用浸提法测得的过氧化值均低于振荡法。原因可能是浸提法提取样品中的油脂较温和，振荡法提取过程中样品与空气中的氧气充分接触混合，加速了其中的过氧化反应，导致过氧化值有所升高。因此，试验选择采用浸提法作为油脂制品中油脂的提取方法。2.1.3黄油和稀奶油提取方法的确定黄油和稀奶油样品直接测定的精密度见表4。由表4可知，黄油和稀奶油样品虽然可以异辛烷-冰乙酸混合溶液，但由于这类样品水分含量高，非脂溶性杂质多，采用直接溶解法测定样品中过氧化值含量，测定结果的重复性较差，对于黄油和稀奶油，也需提取油脂后测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T004表4黄油和稀奶油样品直接测定的精密度项目过氧化值/(mmol/kg)平均值/(mmol/kg)RSD/%123456黄油1.9061.3022.1291.8341.9871.5731.7916.5稀奶油1.4201.0871.0411.0380.7880.9131.0518.6取代表性的黄油和稀奶油样品100 g，加入样品3~5倍的石油醚及10~30 g无水硫酸钠，充分混匀，搅拌溶解，黄油和稀奶油脂肪提取方法见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T005表5黄油和稀奶油脂肪提取方法确定项目称样量/g石油醚体积/mL无水硫酸钠质量/g混合后状态提取残留物的状态及质量（第1次）提取残留物的状态及质量总和（第2次）黄油10030010上层黄色澄清液体，下层少量白色沉淀黄色液体，样品稍浑浊室温冷却为固体，约45 g—10040020上层黄色澄清液体，下层少量白色沉淀澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约42 g—10050030上层黄色澄清液体，下层少量白色沉淀澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约36 g—稀奶油10030010上层少量黄色澄清液，下层大量白色奶油状沉淀黄色液体，样品浑浊，室温冷却为固体，约7.7 g黄色液体，样品浑浊，室温冷却为固体，约17.7 g10040020上层少量黄色澄清液，下层大量白色奶油状沉淀澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约8.9 g澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约14.8 g10050030上层少量黄色澄清液，下层大量白色奶油状沉淀澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约6.4 g澄清透明黄色液体，室温冷却为固体，约15.5 g由表5可知，不同提取体积的石油醚对黄油的提取效率无明显影响，无水硫酸钠用量对黄油中水分和杂质的吸附效果明显，加入量太少导致提取液不澄清。稀奶油产品由于脂肪含量少，浸提时间短会造成提取油脂量较少，且初次提取只能提取少量脂肪样品，为保证样品中脂肪的充分提取，稀奶油样品需静置12 h以上，并进行二次提取。2.2样品测定方法的确定油脂中过氧化值的测定方法主要有指示剂滴定法和电位滴定法[11]。称取制备完成的试样适量置于滴定杯中，在滴定杯中加入50 mL异辛烷-冰乙酸混合溶液，振摇或超声使试样完全溶解。向滴定杯中准确加入碘化钾饱和溶液，分别采用淀粉指示剂和电位突变确定滴定终点，不同方法测定过氧化值的结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T006表6不同方法测定过氧化值结果项目指示剂滴定/(mmol/kg)电位滴定/(mmol/kg)结果玉米油0.710.87—米糠油—7.74溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定玉米糖渣4.103.90—菜籽油—1.17溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定大豆油1.321.22—大豆磷脂油—1.81溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定大豆磷脂油粉—1.39溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定辣椒籽油—3.60溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定黄油2.432.58—稀奶油17.6720.03—猪油2.101.90—鸡油2.372.15—鱼油5.766.27—乳化均衡油粉—1.49溶液颜色较深，指示剂法滴定终点难判定由表6可知，米糠油、菜籽油、大豆磷脂油、大豆磷脂油粉、辣椒籽油和乳化均衡油粉采用淀粉指示剂突变不明显，终点难以判断。所有油脂采用电位滴定法指示终点电位突跃明显，因此，试验选择电位滴定法测定饲料原料油脂的过氧化值。2.3油脂称样量的确定由于饲料原料油脂含杂质较多，颜色较深，称样量过大样品溶解性差，滴定时颜色较难判断，但若过氧化值过低，样品称样量小将导致滴定液消耗太少，误差较大。标准溶液浓度低，消耗滴定液的体积大，能减少滴定误差。但过氧化值的滴定结果容易受外界光照、氧气等影响，若样品的过氧化值过高，使用滴定液浓度偏低会导致滴定时间偏长，也会增大试验误差。按照理论计算，若称样量为5.0 g，当过氧化值为1.2~5.0 mmol/kg时，消耗0.01 mol/L滴定液体积为1.2~5.0 mL，因此，对于过氧化值小于5 mmol/kg的样品，建议称样量为5.0 g。当过氧化值为5~25 mmol/kg时，假设称样量分别为5.0、2.0 g，消耗0.01 mol/L滴定液体积分别为5.0~25.0 mL和2.0~10.0 mL，25 mL超过了10 mL电位滴定仪滴定管的最大体积，因此，对于过氧化值为5~25 mmol/kg的样品，建议称样量为2.0~5.0 g。同样计算得出，对于过氧化值为25~45 mmol/kg的样品，建议称样量为1.0 g。2.4不同来源的试剂空白消耗硫代硫酸钠溶液体积情况（见表7）选取不同厂家及批号的异辛烷和冰乙酸配制异辛烷-冰乙酸混合液（体积比2∶3，现配现用），不加试样，取50 mL混合液于电位滴定仪的滴定杯中，按分析步骤采用等量滴定模式记录滴定终点消耗的标准溶液体积V0。由表7可知，不同来源及批号的空白试剂消耗标准滴定液均没有超过0.1 mL。因此，设定空白试验消耗0.01 mo1/L硫代硫酸钠溶液体积V0不得超过0.1 mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T007表7不同来源的试剂空白消耗硫代硫酸钠溶液体积情况（n=5）项目试剂来源及批号消耗0.01 mol/L硫代硫酸钠滴定液的体积/mL异辛烷冰乙酸混合液1国药化学试剂有限公司20190106国药化学试剂有限公司201911240.031±0.016混合液2上海凌峰化学试剂有限公司20130627上海凌峰化学试剂有限公司201911200.054±0.014混合液3永华化学科技（江苏）有限公司20180213永华化学科技（江苏）有限公司201911200.068±0.0192.5检出限和定量限测定结果将电位滴定仪调整到最佳状态，取50 mL异辛烷-冰乙酸混合液作为空白溶剂，按照分析步骤重复测定空白溶剂中过氧化值含量，平行测定11次，将各测定结果换算成过氧化值的含量（以5 g样品计），计算11次平行测定结果的标准偏差（S）（S=0.026 mmol/kg）。方法的检出限（LOD）以3倍标准偏差S计算，定量限（LOQ）以10倍标准偏差S计算[21]，测得方法的LOD为0.08 mmol/kg，LOQ为0.26 mmol/kg。选取日常检验中过氧化值在定量限附近的样品，平行测定6份，电位滴定法对其中的过氧化值进行测定，定量限附近实际样品的过氧化值精密度RSD测定结果见表8。由表8可知，样品的批内RSD为2.3%~6.9%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T008表8定量限附近实际样品的过氧化值精密度测定结果（n=6）项目电位滴定/(mmol/kg)RSD/%大豆油0.87±0.022.3猪油1.58±0.042.5菜籽油1.17±0.065.1油菜籽0.29±0.026.9玉米油0.64±0.034.7大豆磷脂油粉1.26±0.064.82.6批内精密度测试结果（见表9）选择米糠油、大豆油、菜籽油、玉米油、大豆磷脂油、黄油、稀奶油、辣椒油、乳化均衡油粉、棕榈油脂肪粉、大豆磷脂油粉、猪油和鸡油样品，制备完成后平行称取6份，按照分析步骤进行试验，样品的批内精密度（RSD）为0.8%~4.9%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T009表9批内精密度测试结果项目过氧化值/(mmol/kg)平均值/(mmol/kg)RSD/%123456米糠油7.8387.7887.6227.8477.7757.5907.741.4大豆油1.0351.0501.0031.0111.0261.0231.021.6菜籽油1.1291.1011.1691.2261.1381.2451.174.9玉米油1.9312.0842.0341.9731.9682.0102.002.7大豆磷脂油1.7871.8121.7641.8371.8671.7901.812.1黄油2.6512.5382.5382.5772.6042.5822.581.7稀奶油20.10019.63020.59020.31019.61019.97020.031.9辣椒油6.2186.3456.2886.3256.2636.1976.271.6乳化均衡油粉0.4800.4620.5190.5170.5200.5070.504.8棕榈油脂肪粉5.1885.1745.2075.2355.2765.2775.230.8大豆磷脂油粉0.7170.7100.6590.6950.7070.7100.703.0猪油1.5441.6021.5331.6081.6211.5691.582.3鸡油1.7861.8441.7991.8251.7681.8131.811.52.7批间（仪器间）精密度测定结果（见表10）选择米糠油、大豆油、菜籽油、玉米油、黄油、稀奶油、辣椒油、乳化均衡油粉、棕榈油脂肪粉、大豆磷脂油粉、猪油和鸡油样品，平行称取5份，使用METTLER TOLEDO DL50、瑞士Metrohm 916 Ti-Touch及雷磁ZDJ-4B 3种不同品牌的电位滴定仪测定同一批样品的过氧化值。由表10可知，3个品牌的电位滴定仪测得油脂中过氧化值含量相对标准偏差在0.7%~7.8%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T010表10批间精密度测定结果（n=5）项目过氧化值/(mmol/kg)RSD/%METTLER TOLEDO DL50Metrohm 916 Ti-Touch雷磁ZDJ-4B米糠油1.86±0.041.83±0.051.92±0.062.5大豆油0.93±0.021.08±0.051.05±0.107.8菜籽油1.28±0.051.31±0.071.35±0.062.7玉米油0.69±0.030.67±0.020.68±0.011.5黄油2.68±0.082.81±0.032.78±0.042.5稀奶油14.60±0.3014.40±0.3115.20±0.182.8辣椒油7.60±0.087.52±0.047.85±0.112.2乳化均衡油粉1.25±0.071.28±0.101.35±0.084.0棕榈油脂肪粉6.22±0.146.15±0.096.15±0.100.7大豆磷脂油粉4.01±0.083.96±0.223.97±0.240.7猪油2.58±0.052.62±0.052.84±0.075.2鸡油2.93±0.063.11±0.082.99±0.103.02.8实际样品中过氧化值含量测定结果（见表11）利用试验建立的方法，对市场（或养殖场）采集的大豆油、鱼油、大豆磷脂油、猪油、鸡油、棕榈脂肪粉、乳化均衡油粉、乌贼油、亚麻油、黄油、稀奶油、菜籽油、米糠油、大豆磷脂油粉、辣椒油等15种常见饲料原料油脂中的过氧化值进行测定，平行测定3份。由表11可知，测定过程显示滴定突变明显，实际样品的批内精密度（RSD）为0.9%~9.4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.022.T011表11实际样品中过氧化值含量测定结果（n=3）项目前处理称样量/g过氧化值均值/(mmol/kg)RSD/%大豆油无水硫酸钠去水分2.015.701.9鱼油—2.510.201.7大豆磷脂油先加入异辛烷溶解5.01.388.2猪油45 ℃微热溶解5.01.479.1鸡油45 ℃微热溶解5.02.198.1棕榈油脂肪粉45 ℃微热溶解5.04.522.7乳化均衡油粉石油醚提取5.00.649.4乌贼油无水硫酸钠去水分2.016.300.9亚麻油—5.02.175.4黄油石油醚提取，无水硫酸钠去水分5.00.866.9稀奶油石油醚提取，无水硫酸钠去水分1.026.203.1菜籽油—5.04.573.4米糠油—5.03.813.2大豆磷脂油粉石油醚提取后，先加入异辛烷溶解试样5.01.261.6辣椒籽油无水硫酸钠去水分5.02.623.33结论本试验选取代表性的饲料原料油脂或油脂制品，针对饲料原料油脂杂质多、颜色深等特点，建立了电位滴定法测定饲料原料油脂过氧化值的方法，并按照建立的方法对检出限、批内和批间精密度等开展了验证。结果显示，试验所用检测方法准确可靠，适用于饲料原料过氧化值的检测。