在禁抗形势下，微生态制剂在饲料业和养殖业中的应用越来越广泛[1]。乳酸菌作为一类非常重要的益生菌，能够产生多种短链脂肪酸[2-3]，调节肠道的酸碱环境，抑制肠道有害菌生长[4]，调节肠道微生态平衡[5]。罗伊氏乳杆菌是一种功能性极强的乳酸菌[6]，能够产生胞外多糖来促进动物的肠道健康[7]，增加肠道黏附和益生菌的定植，抑制产肠毒素大肠杆菌的增殖，从而促进动物生长[8]。豆粕是畜禽重要的植物性蛋白饲料[9]，但其抗营养因子含量较高[10]，导致饲料中豆粕不能完全被利用[11]。如何通过现有技术手段实现饲料中豆粕的减量增效是当前饲料业研究的热点。使用罗伊氏乳杆菌可以制备微生物发酵饲料[12]，降解消除多种抗营养因子[13]，提高游离氨基酸和小肽含量，改善饲料适口性[14]，提高诱食量，提升豆粕的消化吸收利用率[15]。本研究从猪场筛选分离、鉴定得到1株产蛋白酶罗伊氏乳杆菌，并进行发酵豆粕试验，探讨该菌株对豆粕营养价值的影响，以期为该菌株在畜禽饲料中的推广应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验粪便试验用粪便样品采自河南省林州市猪场，为出生后未满月仔猪的新鲜粪便。1.1.2试剂与培养基琼脂粉、乙酸钠等常规试剂均为国产分析纯，基因组提取试剂购自北京索莱宝公司，Mix酶、引物等购自华大基因公司，抗营养因子试剂盒购自北京龙科方舟公司。MRS液体培养基：柠檬酸二铵0.2%、乙酸钠0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、吐温8%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.05%、葡萄糖2%、硫酸锰0.025%，pH值6.4，121 ℃灭菌20 min。MRS固体培养基：柠檬酸二铵0.2%、乙酸钠0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、吐温8%、酵母膏0.5%、硫酸镁0.05%、葡萄糖2%、硫酸锰0.025%、琼脂粉2%，pH值6.4，121 ℃灭菌20 min。脱脂乳琼脂培养基：琼脂粉1.5%、脱脂乳粉10%，pH值自然，115 ℃灭菌15 min。1.1.3主要仪器高压蒸汽灭菌锅（美国Chamber公司），控温摇床（上海福玛设备公司），凝胶成像系统（Bio-rad生命医学产品有限责任公司），高速冷冻离心机（美国Thermo公司），荧光显微镜（德国zeiss公司），PCR仪（美国Thermo公司）。1.2试验方法1.2.1样品采集提前将猪圈清理干净，在仔猪排泄高峰时段利用无菌工具收集粪便，放入低温样品保存盒中。1.2.2菌株筛选无菌操作条件下取粪便样品1 g，于100 mL MRS液体培养基中37 ℃摇床培养24 h，取上清液，按照10-1、10-3、10-5、10-7四个浓度梯度逐步稀释，涂布于脱脂乳琼脂平板上，37 ℃培养48 h，观察透明圈较明显的菌株，将产蛋白酶菌株挑出，在MRS平板划线纯化，多次重复直至获得具有目标菌株的单菌落。1.2.3酶活力测定将筛选得到的菌株接种于MRS液体培养基中，在37 ℃、180 r/min培养48 h条件下得到发酵酶液，12 000 r/min离心10 min，得到上清液，即为蛋白酶液。参照《蛋白酶制剂》（GB/T 23527—2009）测定方法测定蛋白酶活力。1.2.4外观形态鉴定目标菌株接种于MRS平板，于37 ℃培养24 h，记录该菌株的外观特征，并对其进行革兰氏染色。1.2.5生理生化鉴定利用筛选得到的目标菌株制作菌悬液，利用乳酸菌生化鉴定试剂盒对目标菌株的生化特性进行鉴定。1.2.6分子生物学鉴定利用基因组提取试剂盒对目标菌株的基因组进行提取。选择27F和1492R为引物进行扩增。扩增完成后送华大基因公司测序，而后进行NCBI BLAST数据库比对，使用MEGA 10.0进行系统进化树的构建，最终结合外观形态特征、生理生化特性及分子生物学结果综合确定菌株种属。1.2.7豆粕固态发酵将目标菌株接种于MRS液体培养基中，在37 ℃、 180 r/min条件下培养24 h，发酵菌液。称取20 g发酵底物（80%豆粕、20%玉米粉），加入8 mL蒸馏水和2 mL发酵菌液，在37 ℃条件下发酵培养48 h。发酵完成后，发酵固体在50 ℃烘干24 h，研磨粉碎，过60目筛，取样并测定相关数据。1.2.8测定指标及方法1.2.8.1抗营养因子含量大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白及大豆胰蛋白酶抑制剂含量采用按照试剂盒步骤进行测定，每个样品做3次重复。1.2.8.2游离氨基酸、酸溶蛋白、小肽含量酸溶蛋白及游离氨基酸含量按照GB/T 22492—2008进行测定，小肽含量为酸溶蛋白含量与游离氨基酸之差。1.2.8.3粗蛋白、粗纤维、粗脂肪含量粗蛋白含量按照GB/T 6432—2018进行测定，粗脂肪含量按照GB/T 6433—2006进行测定，粗纤维含量按照GB/T 6434-2006进行测定。每个样品做3次重复。1.3数据统计与分析采用统计学软件SPSS 19.0对试验结果进行单因素方差分析，LSD法方法多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌株筛选与鉴定结果2.1.1菌株WBT0063的外观形态（见图1）从猪场新鲜仔猪粪便中筛选得到的菌株WBT0063，挑取单菌落划线接种MRS平板。由图1（a）可知，此菌株菌落形状呈圆形，略隆起，颜色呈乳白色或白色，边缘整齐光滑。由图1（b）可知，此菌株表现出较强的产蛋白酶能力。由图1（c）可知，革兰氏染色结果为阳性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.F001图1菌株WBT0063的外观形态2.1.2菌株WBT0063生化反应结果（见表1）利用乳酸菌生化鉴定试剂盒对菌株WBT0063进行生化特性试验。由表1可知，试验结果符合罗伊氏乳杆菌的生化特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.T001表1菌株WBT0063生化反应结果项目七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉籽糖菊糖乳糖1%马尿酸钠结果+-+---++-++注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。2.1.3菌株WBT0063 DNA电泳结果（见图2）对目标菌株WBT0063的DNA进行提取，并对16S rDNA进行PCR扩增。由图2可知，扩增产物长度为1 418 bp，处于1 000~2 000 bp，符合细菌的一般特征。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.F002图2菌株WBT0063DNA电泳结果注：Marker为DL2000 plus，WBT0063为PCR扩增产物。2.1.4菌株WBT0063系统发育树（见图3）将16S rDNA扩增序列导入NCBI BLAST数据库进行比对，结果发现其与罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）相似性最高，而后利用MEGA 10.0进行系统进化树的构建。由图3可知，该菌株与罗伊氏乳杆菌亲缘关系最近。结合其他试验结果，综合确定编号WBT0063的菌株为罗伊氏乳杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.F003图3菌株WBT0063系统发育树2.2β-甘露聚糖酶活力测定将筛选得到的菌株发酵以后取上清液，参照《蛋白酶制剂》（GB/T 23527—2009）方法测定蛋白酶活力。测得蛋白酶活力为9.8 U/mL。2.3发酵产物中抗营养因子降解率（见表2）由表2可知，发酵后产物中大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂含量均低于发酵前，其中大豆球蛋白降解率达到48.06%，β-伴大豆球蛋白降解率达到39.75%，大豆胰蛋白酶抑制剂降解率达到60.15%，表明该菌株具有明显的降解抗营养因子能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.T002表2发酵产物中抗营养因子降解率项目发酵前含量/(mg/g)发酵后含量/(mg/g)发酵后降解率/%大豆球蛋白89.45±2.3546.44±0.4948.06±0.86β-伴大豆球蛋白74.89±2.0345.12±1.8939.75±1.99大豆胰蛋白酶抑制剂5.97±0.122.38±0.0960.15±2.232.4发酵产物中游离氨基酸、酸溶蛋白、小肽含量变化（见表3）由表3可知，发酵产物中大部分氨基酸含量均高于发酵前。蛋氨酸和缬氨酸含量变化最为明显，发酵产物蛋氨酸含量为发酵前的2倍，发酵产物缬氨酸含量为发酵前的1.87倍，苏氨酸、丙氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸含量均为发酵前的1.5倍以上。发酵产物游离氨基酸总和是发酵前的1.23倍。发酵产物的酸溶蛋白含量是发酵前的2.14倍，发酵产物的小肽含量是发酵前的2.73倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.T003表3发酵产物中游离氨基酸、酸溶蛋白、小肽含量变化项目发酵前发酵后天冬氨酸0.340.46苏氨酸0.100.16丝氨酸0.060.06谷氨酸1.191.32甘氨酸0.070.10丙氨酸0.300.47胱氨酸0.080.14缬氨酸0.150.28蛋氨酸0.040.08异亮氨酸0.040.06亮氨酸0.100.18酪氨酸0.060.06苯丙氨酸0.300.38赖氨酸0.230.36组氨酸0.120.12精氨酸1.020.97脯氨酸0.170.16游离氨基酸总和4.375.36酸溶蛋白质11.1023.70小肽6.7318.34g/kg2.5发酵产物中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量变化（见表4）由表4可知，与发酵前相比，发酵产物的粗蛋白含量提高了22.7%（P0.05），粗脂肪含量提高了38.0%（P0.05），粗纤维含量降低了34.8%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.016.T004表4发酵产物中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量变化项目粗蛋白质/%粗脂肪/(g/kg)粗纤维/%发酵前39.23±0.36a7.10±0.09a2.30±0.02a发酵后48.14±0.37b9.80±0.11b1.50±0.01b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）。3讨论豆粕是畜禽养殖饲料的主要蛋白原料[16-17]，但豆粕中植物蛋白含量较高[18]。植物蛋白分子量较大，不易被消化吸收，导致动物对饲料的消化利用率较低[19]。目前，微生物发酵技术是提高豆粕利用率的有效方法之一[20]。王慧等[21]发现，利用发酵豆粕替代日粮中75%豆粕能够明显提高育肥猪的生长性能、屠宰性能及经济效益。Zhang等[22]利用副干酪乳杆菌制备发酵豆粕，研究发酵豆粕对大菱鲆生长性能及肠道健康的影响，发现发酵豆粕能够替代高达45%的鱼粉，降低养殖成本。本研究从仔猪新鲜粪便中得到1株罗伊氏乳杆菌，通过发酵豆粕试验，发现大豆球蛋白降解率达到48.06%，β-伴大豆球蛋白降解率达到39.75%，大豆胰蛋白酶抑制剂降解率达到60.15%，表明菌株WBT0063具有明显的降解抗营养因子能力。发酵产物的大部分氨基酸含量均高于发酵前，与发酵前相比，发酵产物的粗蛋白含量提高了22.7%，粗脂肪含量提高了38.0%，粗纤维含量降低了34.8%。本研究表明，筛选的罗伊氏乳杆菌能够明显提高豆粕的营养价值，保障豆粕的高效利用。4结论从猪场仔猪新鲜粪便中筛选到1株产蛋白酶乳酸菌，通过鉴定确定该菌株为罗伊氏乳杆菌。发酵豆粕试验结果表明，该罗伊氏乳杆菌可以提高豆粕的营养价值，能够在发酵豆粕中加以推广和应用。