无花果叶是桑科植物无花果（Ficus carica L.）的叶片[1]。无花果叶提取物具有抗菌[2-3]、降血糖[4]、抗炎[5]、抗氧化[6]等多种药理作用，黄酮是无花果叶中主要药效成分之一。在饲粮中添加总黄酮能够提高蛋鸡的生产性能[7]，增强蛋鸭的免疫力[8]，提高肉鸡的生长性能[9]。目前，提取无花果叶黄酮的方法有超声波提取[10-12]、微波提取[13]、超声酶辅助双水相萃取法[14]等，尚无采用闪氏提取无花果叶中总黄酮的研究。闪式提取法依靠高速机械剪切力快速破碎植物组织，通过剧烈搅拌，产生超速动态分子渗透作用和强力振动作用，在适当溶剂的存在下，短时间内使有效成分达到组织内外平衡，最后脱离药材进入溶剂中，从而实现提取的目的。闪式提取法具有快速、效率高、操作简单等优点[15-16]。Box-Behnken响应面法是对影响因素进行设计，以回归方法作为函数估算的工具，可用于设计和优化提取工艺参数[17]。本试验采用闪式提取技术，使用响应面法优化提取条件，提高无花果叶总黄酮的利用率，研究其体外抗氧化活性，为无花果叶总黄酮开发成为天然饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂无花果叶于2021年10月采摘于山西农业大学生命科学学院实训基地。芦丁标准品购自中国食品药品检定研究院，NaNO2、Al(NO)3、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、FeSO4、无水乙醇购自天津市光复科技发展有限公司，Tris、HCl、H2O2、邻苯三酚、VC、邻二氮菲、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自上海源叶生物科技有限公司。上述药品均为分析纯。1.2仪器设备SBZ-019粉碎机购自天津泰斯特有限公司，JHBE-50T闪式提取器购自河南智晶生物科技股份有限公司，GZX-9023MBE数显鼓风干燥箱购自上海博讯实业有限公司，7200型紫外可见分光光度计购自尤尼克（上海）仪器有限公司，5424R离心机购自德国Eppendorf公司。1.3测定指标及方法1.3.1样品处理无花果叶放于烘箱中，烘干至恒重，使用粉碎机粉碎，过80目筛，保存。1.3.2提取流程无花果叶粉末→粉碎（80目筛）→乙醇浸泡→闪氏提取→提取液→浓缩→干燥→无花果叶总黄酮提取物。1.3.3芦丁标准曲线在20 mg芦丁标准品中加入适量无水乙醇，晃动至完全溶解，转移至容量瓶中，使用60%乙醇定容，得到0.2 g/L的芦丁标准溶液。向6个25 mL容量瓶分别移取0、1、2、3、4、5 mL芦丁标准液，分别加入0.3 mL 5% NaNO2，充分振摇，静置6 min，分别加入0.3 mL 10% Al(NO)3，振摇，放置6 min，加入4 mL 1mol/L的NaOH，使用60%乙醇定容至刻度线，充分振摇，静置15 min。在波长510 nm处分别测定其吸光度值，得到无花果叶总黄酮的线性回归方程y=9.278 6x+0.000 4（R2=0.999 6）。1.3.4总黄酮含量准确称取无花果叶粉末1.5 g放于蓝盖玻璃瓶中，加入适量体积分数的乙醇，在闪式提取器下进行闪式提取，提取液倒入50 mL离心管中，6 000 r/min进行离心6 min，上清液即为提取液。除对照组外分别移取0.5 mL上述上清液于10 mL离心管中，按照标准曲线制作1.3.3步骤依次加入显色剂，定容，3 000 r/min离心8 min，取上清液为待测液，分别在510 nm处测定吸光度A。根据芦丁标准曲线计算待测液中的总黄酮浓度，计算无花果叶总黄酮提取率。E=c×V×Fm×100% (1)式中：E为总黄酮提取率（%）；c为黄酮溶液的质量浓度（g/L）；V为黄酮溶液定容的体积（mL）；F为稀释倍数；m为无花果叶细粉质量（mg）。分别研究提取时间（70、80、90、100、110 s）、乙醇体积分数（30%、40%、50%、60%、70%）、液料比（50、60、70、80、90 mL/g）对无花果叶总黄酮提取率的影响。1.3.5响应面试验根据单因素试验结果，以无花果叶总黄酮提取率为响应值，采用Box-Behnken Design法进行3因素3水平试验设计。响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.T001表1响应面试验因素水平设计水平A提取时间/sB乙醇体积分数/%C液料比/(mL/g)-18050700906080110070901.3.6抗氧化性以最佳提取条件下的提取液为母液，配制不同梯度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L）的总黄酮溶液作为样品液，测定试验均重复3次，均以半数清除浓度（IC50）作为抗氧化活性评价指标进行对比。1.3.6.1DPPH自由基清除能力参照文献[18]方法适当修改，1 mL样品+2.5 mL DPPH溶液、1 mL样品+2.5 mL无水乙醇、1 mL无水乙醇+2.5 mL DPPH溶液，DPPH溶液浓度为0.1 mmol/L，在室温避光条件下反应30 min，测定其在波长517 nm处的吸光度值，每30 s记录1次，直至5 min，对照物为同浓度下的VC标准液。计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=1-(A0-A1)A2×100% (2)式中：A0为1 mL样品+2.5 mL DPPH溶液在517 nm的吸光度；A1为1 mL样品+2.5 mL无水乙醇在517 nm的吸光度；A2为1 mL无水乙醇+2.5 mL DPPH溶液在517 nm的吸光度。1.3.6.2羟基自由基清除能力参照文献[19]方法适当修改，4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+2 mL蒸馏水、4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+1 mL蒸馏水+1 mL H2O2、4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+1 mL样品+1 mL H2O2，37℃水浴反应l h，反应充分后调节波长至536 nm处测定吸光度，每30 s记1次吸光度，直至5 min，对照物为同浓度下的VC标准液。计算羟基自由基清除率。羟基自由基清除率=A5-A4A3-A4×100% (3)式中：A3为4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+2 mL蒸馏水在536 nm处吸光度，A4为4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+1 mL蒸馏水+1 mL H2O2在536 nm处吸光度；A5为4 mL磷酸钠缓冲溶液+1.5 mL邻二氮菲应用液+1 mL FeSO4+1 mL样品+1 mL H2O2在536 nm处吸光度。1.3.6.3超氧阴离子自由基清除率参照文献[20]方法适当修改，分别加入1 mL样品+4.5 mL Tris-HCl缓冲液+0.5 mL邻苯三酚、1 mL样品+5 mL Tris-HCl缓冲液、5.5 mL Tris-HCl+0.5 mL邻苯三酚，调节波长为325 nm，使用石英比色皿，每30 s记1次吸光度，直至5 min，对照物为同浓度下的VC标准液。计算超氧阴离子自由基清除率。超氧阴离子自由基清除率=1-(A6-A7)A8×100% (4)式中：A6为1 mL样品+4.5 mL Tris-HCl缓冲液+0.5 mL邻苯三酚在波长325 nm的吸光度；A7为1 mL样品+5 mL Tris-HCl缓冲液在波长325 nm的吸光度；A8为5.5 mL Tris-HCl+0.5 mL邻苯三酚在波长325 nm的吸光度。1.4数据统计与分析采用Excel 2010对试验数据制图，采用Design Expert 12.0.3软件进行响应面结果分析和图形输出。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1提取时间对无花果叶总黄酮提取率的影响（见图1）由图1可知，随着提取时间的增加，无花果叶总黄酮提取率逐渐提高，90 s时总黄酮提取率为最高值；90~110 s总黄酮提取率随着提取时间的延长而下降。原因可能是提取时间过长，闪氏提取器刀头高速旋转产生大量的热，导致溶剂温度升高，部分黄酮类物质发生分解，影响提取率[21]。因此，选择90 s为最佳提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F001图1提取时间对无花果叶总黄酮提取率的影响2.1.2乙醇体积分数对无花果叶总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率也在升高，在乙醇体积分数为60%时得到提取率最大值；当乙醇体积分数为60%~70%时，总黄酮提取率随着体积分数的升高而减小。原因可能是乙醇浓度过高时，非黄酮类成分如脂溶性物质浸出含量增加，影响黄酮的提取效率[22]。因此，选取60%为最佳乙醇体积分数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F002图2乙醇体积分数对无花果叶总黄酮提取率的影响2.1.3液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，随着液料比增大，无花果叶总黄酮提取率逐渐增大，当液料比为80 mL/g时得到最大提取率；液料比大于80 mL/g时，总黄酮提取率随着液料比的增大而减小。原因可能是当溶剂量达某一值时，植物组织内外质量浓度差达到平衡，总黄酮成分浸出饱和，随着溶剂量的增加，提高效果不明显，可能会有其他物质浸出，影响总黄酮的提取率，且造成溶剂浪费[23]。因此，选择80 mL/g为最佳液料比。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F003图3液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响2.2响应面试验及方差分析结果（见表2、表3）由表2可知，根据Box-Behnken Design方法可以设计出17组不同组合的试验方案。得到回归方程为：Y=3.20-0.084A+0.51B+0.031C-0.032AB+0.090AC+0.34BC-0.069A2-0.52B2-0.17C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.T002表2响应面法试验结果试验号ABC提取率/%10002.9021103.003-10-13.11410-12.81501-12.6060-1-12.2871-102.0180002.9490003.54100113.41110003.3812-1103.28131012.98140003.2315-1-102.16160-111.7417-1012.92由表3可知，乙醇体积分数（B）对无花果叶总黄酮提取率具有显著影响（P0.05）。各因素对总黄酮提取率影响排序为乙醇体积分数（B）提取时间（A）液料比（C）。模型失拟项P0.05，表明该模型的选取合理。回归模型的决定系数R2=0.925 2，表明该模型的相关度比较好，拟合度比较高，变异系数CV=7.57%，表明试验可信度和精确度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.T003表3回归模型的方差分析结果项目平方和自由度方差F值P值模型4.00090.4409.6200.003 5A0.05610.0561.2100.306 8B2.10012.10045.4900.000 3C7.812×10-317.812×10-30.1700.693 2AB4.225×10-314.225×10-30.0910.771 1AC0.03210.0320.7000.429 9BC0.46010.4609.8600.016 4A20.02010.0200.4300.531 1B21.12011.12024.3200.001 7C20.13010.1302.7600.140 6残差0.32070.046失拟项0.01735.608×10-30.0730.971 2纯误差0.31040.077总和4.32016注：1.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.R2=0.925 2，CV=7.57%。2.3各因素交互作用对无花果叶总黄酮提取率的影响（见图4~图6）由图4可知，固定提取时间（A）或乙醇体积分数（B）中的任意一值，提取率都会随着另外值的增大而先升高后降低，提取时间的曲线斜度与乙醇浓度相比要稍微平坦些，二者的交互作用不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F004图4提取时间与乙醇体积分数对无花果叶总黄酮提取率的影响由图5可知，固定提取时间（A），提取率随液料比（C）的增大变化不明显；固定C，提取率随A增大变化也不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F005图5提取时间与液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响由图6可知，固定B或C中的任意一值，提取率均会随着另一因素的增大而先升后降，B的曲线斜度比C更陡些。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F006图6乙醇体积分数与液料比对无花果叶总黄酮提取率的影响2.4响应面优化条件验证结果通过对拟合方程和回归模型进行分析，根据响应面分析法所获得的无花果叶总黄酮最佳闪式提取工艺为提取时间86.95 s、乙醇体积分数67.45%、液料比87.33 mL/g，无花果叶总黄酮提取率理论值为3.41%。根据操作中的实际情况对参数进行修正，设置提取时间87 s、乙醇体积分数67%、液料比87 mL/g。在该工艺下进行3次重复试验，得到的最终提取率为3.43%，与响应面的理论预测值基本一致，说明利用响应面法预测提取率较为可靠。2.5无花果叶总黄酮抗氧化性结果2.5.1无花果叶总黄酮对DPPH自由基清除作用（见图7）由图7可知，无花果叶总黄酮质量浓度为0.02 g/L时，对DPPH的清除效果明显提高，达73.93%；当其质量浓度从0.02 g/L升至0.10 g/L时，其清除能力保持平稳状态；当总黄酮质量浓度为0.10 g/L时，其清除率为90.73%，与相同浓度下VC的清除率89.85%比较，清除率几乎相同。总黄酮提取液和VC的IC50分别为0.019、0.035 g/L，表明无花果叶总黄酮具有较好的清除DPPH自由基的能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F007图7无花果叶总黄酮对DPPH自由基清除作用2.5.2无花果叶总黄酮对超氧阴离子自由基清除作用（见图8）由图8可知，在无花果叶总黄酮质量浓度为0.02 g/L时，总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率明显提高，达到74.77%；总黄酮在0.02~0.10 g/L质量浓度范围内清除率增长幅度较小，且与同浓度VC的清除率差别不明显；当总黄酮质量浓度进一步增加至0.10 g/L时，对超氧阴离子自由基的清除率达到92.74%。总黄酮提取液和VC的IC50分别为0.017、0.014 g/L，表明无花果叶总黄酮清除超氧阴离子自由基的能力接近VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F008图8无花果叶总黄酮对超氧阴离子自由基清除作用2.5.3无花果叶总黄酮对羟自由基清除作用（见图9）由图9可知，随着无花果叶总黄酮质量浓度从0.02 g/L提升至0.06 g/L，对羟自由基的清除率保持着缓慢上升趋势；当总黄酮质量浓度为0.06~0.10 g/L)时，随着总黄酮质量浓度的增加，清除率增长趋势加快；在质量浓度为0.10 g/L时，无花果总黄酮羟自由基清除率为52.66%，明显高于同一浓度下VC的清除率（33.41%）。总黄酮提取液和VC的IC50分别为0.076、0.056 g/L，说明无花果叶总黄酮具有较好的清除羟自由基的能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.013.F009图9无花果叶总黄酮对羟基自由基清除作用3结论本试验通过响应面法得到的最优工艺为提取时间87 s、乙醇体积分数67%、液料比87 mL/g，无花果叶中总黄酮提取率为3.43%，实际提取率与方程预测值接近。体外抗氧化试验表明，在相同质量浓度下，无花果叶中总黄酮提取物的DPPH自由基、超氧阴离子自由基的清除率均高于或接近VC。在总黄酮质量浓度为0.08~0.10 g/L时，羟自由基清除能力明显高于VC，表明无花果叶总黄酮提取物在体外能够有效清除自由基，具有良好的抗氧化活性。