吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）是1种吲哚类具有生长素活性的广谱性植物生长调节剂，通过调控细胞膜电子通道和质子通道调节植株生长。IAA不仅存在于植物中，也存在于动物机体的某些部位[1]，被认为是动物体内色氨酸的代谢物[2-3]。自科学家发现巴西固氮螺菌能够合成IAA后，陆续发现土壤中约有一半种类的细菌能够产生IAA[4-5]。动物饲料添加剂是在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质，在饲料中用量很少但作用显著，包括矿物质、酶、维生素、氨基酸、植物源添加剂等[6]，在增强动物机体免疫力、促进动物生长和提升肉类品质等方面应用广泛[7]。IAA及其衍生物可以作为动物饲料添加剂，对家畜、家禽、鱼类具有显著的促生长作用[8-10]。本研究针对实验室前期筛选保存的1株产IAA野生菌株，对其进行菌种鉴定，同时以IAA含量为指标，利用单因素和正交试验对其培养基成分和发酵条件进行优化，旨在丰富IAA发酵菌种资源库，为饲料添加剂生产提供技术支持。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种菌株HS5B5由河南科技大学农学院特色生物资源开发与利用实验室提供，4 ℃冰箱保存。1.1.2基础培养基LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl，pH值7。1.1.3显色剂Salkowski显色剂：0.5 mol/L FeCl3与35% HClO4，按1∶50混合，避光保存。1.2方法1.2.1菌株鉴定形态观察包括对菌落形态的观察和对细菌个体形态的观察；生理生化试验包括接触酶反应、好氧性试验等试验；16S rDNA序列测定及系统发育树的构建包括基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、纯化测序、序列比对等步骤[11]。1.2.2IAA含量测定采用梯度稀释的IAA标准溶液绘制标准曲线。将菌株按3%接种量接种于基础培养基中，28 ℃、180 r/min条件下摇床培养18 h，8 000 r/min离心15 min，取上清液与等体积Salkowski显色剂混合，25 ℃避光反应30 min，使用酶标仪测定OD530 nm值[12]。根据IAA标准曲线计算发酵液中IAA含量。后续发酵条件优化试验中发酵液按上述步骤测定IAA含量。1.2.3单因素试验以基础培养基为初始培养基，以接种量3%、培养温度28 ℃、180 r/min振荡培养18 h为初始发酵条件，进行单因素试验[13]。碳源及其浓度的确定：以10 g/L的葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖为碳源，碳源浓度梯度分别为5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L，研究不同碳源及碳源浓度对IAA含量的影响。氮源及其浓度的确定：以10 g/L的硫酸铵、硝酸钾、尿素、牛肉膏为氮源，氮源浓度梯度分别为5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g/L，研究不同氮源及氮源浓度对IAA含量的影响。无机盐及其浓度的确定：以1 mmol/L的硫酸镁、氯化钙、硫酸锰、硫酸钙为无机盐，无机盐浓度梯度分别为1、2、3、4、5 mmol/L，研究不同无机盐及浓度对IAA含量的影响。接种量：分别按1%、3%、5%、7%和9%的接种量接种于基础培养基中，研究不同接种量对IAA含量的影响。pH值：将基础培养基pH值分别调至为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，研究不同pH值对IAA含量的影响。温度：基础培养基培养温度分别为24、26、28、30、32 ℃，研究不同培养温度对IAA含量的影响。装液量：100 mL三角瓶中装液量分别20、30、40、50、60 mL，研究不同装液量对IAA含量的影响。以上试验均设置3个重复，分别测定发酵液中IAA含量。1.2.4正交试验以甘露醇、牛肉膏、氯化钙、接种量、pH值、温度、装液量为因素，各因素设置3个水平，以发酵液中IAA含量为指标[14]，设计菌株HS5B5发酵条件优化的L18(37)正交试验，试验3次重复。正交试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.T001表1正交试验设计水平A甘露醇/(g/L)B牛肉膏/(g/L)C氯化钙/(mmol/L)D接种量/%E pH值F温度/℃G装液量/mL15.07.5266.7272527.510.0377.02830310.012.5487.32935菌株HS5B5在优化后的条件下培养18 h，测定发酵液中IAA含量，对优化得到的培养基成分和发酵条件进行验证。1.3数据统计与分析采用Excel 2010、SPSS 21.0软件对试验数据进行处理和统计分析，采用Origin 2021绘图。2结果与分析2.1菌株鉴定2.1.1形态观察（见图1）由图1可知，菌株的菌体形态为杆状，长（2.3±0.2）μm，宽（0.8±0.1）μm，革兰氏染色阳性，中生芽孢，周生鞭毛。菌落白色，圆形或近圆形，干燥有皱褶，不透明，边缘呈缺刻状。初步推断菌株HS5B5可能属于细菌芽孢杆菌属（Bacillus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F001图1菌株HS5B5的菌落特征及革兰氏染色2.1.2生理生化试验菌株HS5B5生理生化特征见表2。参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]，菌株HS5B5生理生化特征与芽孢杆菌属（Bacillus）特征相符，进一步确定菌株HS5B5属于芽孢杆菌属（Bacillus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.T002表2菌株HS5B5生理生化特征项目结果项目结果接触酶反应+淀粉水解试验+严格好氧+酪素水解试验+甲基红反应+H2S产生试验-V-P反应试验+2% NaCl+硝酸盐还原试验+5% NaCl+葡萄糖产酸+7% NaCl+乳糖产酸-10% NaCl+甘露醇产酸+温度45 ℃+葡萄糖产气-温度65 ℃-吲哚产生试验-运动性+柠檬酸盐利用试验+注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应。2.1.316S rDNA测序利用BLAST将菌株的16S rDNA的序列与GenBank数据库中已知序列进行比对，采用MEGA 6.0软件进行同源性分析并构建系统发育树，见图2。由图2所示，菌株HS5B5与枯草芽孢杆菌同属一个分支，和已知菌株枯草芽孢杆菌QB61的亲缘关系最为接近，同源性达到99.5%。结合菌株个体形态、菌落形态以及生理生化试验的结果，菌株HS5B5为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F002图2菌株HS5B5系统发育树2.2菌株HS5B5培养条件的确定2.2.1IAA标准曲线（见图3）通过Salkowski比色试验，确定枯草芽孢杆菌HS5B5代谢的过程中可以产生IAA，以IAA的浓度为纵坐标（y），吸光度OD530 nm为横坐标（x）制作标准曲线，并得到线性回归方程y=40.12x+0.680 1，R2=0.998 8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F003图3IAA标准曲线2.2.2单因素试验结果2.2.2.1不同碳源对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图4）由图4可知，麦芽糖作为碳源时，菌株HS5B5发酵液IAA含量最低，为（20.00±0.16）mg/L，且与其他3种碳源具有显著差异（P0.05）。甘露醇作为碳源时，IAA含量最多，为（54.67±0.45）mg/L，与其他3种碳源具有显著差异（P0.05）。因此，选择甘露醇作为正交试验中的碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F004图4不同碳源对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响注：不同字母表示数据差异显著（P0.05），下图同。2.2.2.2甘露醇浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图5）由图5可知，甘露醇作为碳源时，甘露醇浓度在10.0、12.5、15.0 g/L时IAA含量较低，且与其他2种浓度具有显著差异（P0.05）。甘露醇浓度为5.0、7.5 g/L时，IAA含量为（47.91±1.86）、（57.61±0.28） mg/L，两者之间存在显著差异（P0.05）。甘露醇浓度为7.5 g/L时，IAA含量最多。因此，选择5.0~10.0 g/L作为正交试验碳源不同水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F005图5甘露醇浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.3不同氮源对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图6）由图6可知，尿素作为碳源时，菌株HS5B5发酵液IAA含量最低为（24.57±0.61） mg/L，且与其他3种氮源具有显著差异（P0.05）。牛肉膏作为氮源时，IAA含量最多，为（42.42±1.28）mg/L，与其他3种氮源具有显著差异（P0.05）。因此，选择牛肉膏作为正交试验中的氮源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F006图6不同氮源对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.4牛肉膏浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图7）由图7可知，牛肉膏作为氮源，牛肉膏浓度为5.0 g/L时，IAA含量最低，为（38.90±0.93）mg/L。牛肉膏浓度为10.0 g/L时，IAA含量最高，为（53.06±0.48）mg/L，与其他浓度下IAA含量之间存在显著差异（P0.05）。因此，选择7.5~12.5 g/L作为正交试验氮源不同水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F007图7牛肉膏浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.5不同无机盐对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图8）由图8可知，硫酸镁作为无机盐时，菌株HS5B5发酵液IAA含量最低，为（34.10±0.86）mg/L，但与硫酸锰、硫酸钙两种无机盐的IAA产量无显著差异（P0.05）。氯化钙作为无机盐时，IAA含量最多，为（44.52±3.38）mg/L，与其他3种无机盐之间存在显著差异（P0.05）。因此，选择氯化钙作为正交试验中的无机盐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F008图8不同无机盐对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.6氯化钙浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图9）由图9可知，氯化钙浓度为5 mmol/L时，IAA含量最低，为（35.64±0.72）mg/L。氯化钙浓度为3 mmol/L时，IAA含量最多，为（50.19±0.32）mg/L，与其他浓度下IAA含量之间存在显著差异（P0.05）。因此，选择2~4 mmol/L作为正交试验无机盐不同水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F009图9氯化钙浓度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.7不同接种量对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图10）由图10可知，接种量1%和3%之间无显著差异（P0.05），接种量5%和9%之间也无显著性差异（P0.05）。随着接种量增加，IAA含量先增高后降低，接种量为7%时，与其他接种量差异显著（P0.05），IAA含量最高，为（49.60±0.32）mg/L。因此，选择接种量5%~9%为正交试验参考范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F010图10不同接种量对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.8不同pH值对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图11）由图11可知，培养基不同初始pH值对菌株HS5B5发酵液IAA含量有不同影响。当pH值为7.0时，IAA含量最高，为（47.94±3.82）mg/L，显著高于其他pH值条件下的IAA含量。当pH值为8.0时，IAA含量最少，为（34.44±0.26）mg/L，说明pH值为8.0时，对菌株HS5B5分泌IAA有影响。因此，选择pH值6.5~7.5作为正交试验参考范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F011图11不同pH值对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.9不同温度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图12）由图12可知，不同培养温度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响不同，高温和低温都不利于生产IAA。培养温度大于28 ℃，IAA含量显著下降；培养温度为24 ℃时，IAA含量显著低于其他处理（P0.05）；培养温度为28 ℃时，发酵液中IAA含量最高，为（38.97±0.19）mg/L，说明菌株在适宜的温度时可以高效分泌IAA，这将有利于菌剂在生产上的应用。因此，选择26~30 ℃作为正交试验温度水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F012图12不同温度对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.2.10不同装液量对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响（见图13）由图13可知，装液量对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响有极显著影响，当装液量超过30 mL后，随着装液量的增加，发酵液中IAA含量逐渐减少。当装液量为30 mL时，IAA含量最高，为（39.35±0.49）mg/L。装液量为30 mL时，IAA含量次之。因此，选择20~30 mL作为正交试验液体装液量不同水平范围。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.F013图13不同装液量对菌株HS5B5发酵液IAA含量的影响2.2.3正交试验结果正交试验极差分析见表3，方差分析见表4。由表3可知，正交试验中IAA含量最高达（103.95±0.84）mg/L，IAA含量最低仅为（47.84±0.79）mg/L。由极差R值可以得出，影响菌株HS5B5发酵最大的因素是pH值，极差R值最大。由表4可知，pH值和温度对IAA含量有极显著性影响（P0.01）。甘露醇浓度和氯化钙浓度对IAA含量有显著影响（P0.05）。接种量、装液量和牛肉膏浓度对IAA含量无显著影响（P0.05）。影响因素主次顺序为pH值温度甘露醇氯化钙接种量装液量牛肉膏。综合表3和表4的分析结果，最佳发酵条件组合为A1B1C1D1E3F2G2，即甘露醇添加量5.0 g/L、牛肉膏添加量7.5 g/L、氯化钙添加量2 mmol/L、接种量6%、pH值7.3、温度28 ℃、装液量30 mL。以得到的最佳培养基成分和发酵条件组合进行验证试验，优化后发酵液中IAA含量为（108.90±1.10）mg/L，比优化前在初始培养基和发酵条件下的（38.47±0.76）mg/L提高183.08%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.T003表3正交试验极差分析项目A甘露醇B牛肉膏C氯化钙D接种量E pH值F温度G装液量IAA含量/(mg/L)1111111176.63±1.122222122281.87±1.883333133399.06±0.874233211247.84±0.795311222377.58±1.586122233173.48±2.187323312156.27±3.458131323285.06±1.789212331356.90±1.5910221113366.74±1.1811332121166.97±1.56121131322103.95±0.8413132212379.50±2.1514213223187.11±0.5415321231287.86±0.8916312312280.92±1.6717123323391.43±0.8818231331199.27±1.71k185.0180.5282.1982.5467.9871.2776.62k273.2976.2873.2775.5681.6783.0781.25k378.1179.6280.9478.3186.7582.0678.53R11.724.248.926.9718.7711.84.6310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.012.T004表4正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值校正模型7 867.7116491.733.870.00截距335 318.721335 318.722 643.440.00甘露醇1 249.192624.594.920.01牛肉膏179.91289.960.700.49氯化钙839.502419.753.300.04接种量444.262222.131.750.19pH值3 392.3521 696.1813.370.00温度1 540.682770.346.070.00装液量194.83297.420.760.47重复组26.96213.480.100.89误差4 693.4237126.85总计347 879.8554校正的总计12 561.1353注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。3讨论经革兰氏染色后供试菌株确定为革兰氏阳性菌，在显微镜下观察单个菌体的形态均为杆状。构建系统进化树，可以看到供试菌株与枯草芽孢杆菌QB61聚在1个分支上，其形态特征、生理生化及分子生物学鉴定结果与毛多斌等[16]、刘晓燕等[17]研究结果相符，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。本试验通过比较培养基中IAA含量确定甘露醇为最佳碳源。张之矾等[18]对5种芽孢杆菌碳源代谢表型分析研究表明，甘露醇是枯草芽孢芽孢杆菌高效代谢的碳源之一。有机氮源从硫酸铵、硝酸钾、尿素和牛肉膏中进行选择，确定的最佳有机氮源为牛肉膏，牛肉膏当中含有多肽类、氨基酸类等水溶性物质，对微生物生长和正常代谢有促进作用。无机盐作为维持微生物生命活动的基础物质，在发酵培养基中必不可少。李冠杰等[19]在对地衣芽孢杆菌产IAA发酵条件优化研究时，发现氯化钙浓度为0.1 g/L时，IAA含量最高。吴翔等[20]研究表明，0.13%的CaCl2·2H2O对菌株产IAA有促进作用。本试验中，氯化钙浓度为2 mmol/L时，培养基中IAA含量最高。接种量是影响发酵液代谢产物含量的重要因素之一。接种量过少，菌群繁殖较慢，导致发酵代谢产物积累较少；接种量过多，营养物质会加快消耗，不利于发酵产物的积累[21]。试验结果显示，接种量为6%时，培养基中IAA含量最高。李洪康等[22]在枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件优化试验中，选择的最佳接种量为6%，与本研究一致。当培养基中的pH值超过或低于微生物适宜生长范围时，其生长受到抑制，代谢产物也会受到影响。pH值对IAA含量有较大的影响，芽孢杆菌属在中性和弱碱性时适宜产生IAA[23]。本试验中，最佳pH值为7.3，培养基中IAA含量最高，与前人研究一致。酶的催化作用在微生物生长代谢过程中非常重要，温度是影响微生物体内酶活性主要因素之一。试验结果表明，随着温度的升高，培养基中IAA含量呈现先上升后下降的趋势，最终确定枯草芽孢杆菌HS5B5的最佳发酵温度为28 ℃，此时IAA含量最高。在摇瓶发酵中，装液量是影响发酵液溶氧量的主要因素之一。试验结果表明，当装液量为30 mL时，培养基中IAA含量最高。发酵过程中装液量过多会导致培养基中溶氧量下降，菌体的生长受到抑制，在发酵过程中存在液体的少量蒸发，装液量过少同样影响菌体的生长繁殖[24]。4结论对产IAA野生菌株HS5B5进行形态观察、生理生化试验和16S rDNA序列分析，菌株HS5B5为枯草芽孢杆菌。通过单因素试验和L18(37)正交试验对该菌培养基成分和发酵条件进行优化，得到最佳组合为A1B1C1D1E3F2G2，分别为甘露醇添加量5.0 g/L、牛肉膏添加量7.5 g/L、氯化钙添加量2 mmol/L、接种量6%、pH值7.3、温度28 ℃、装液量30 mL。优化后IAA含量提高效果显著，发酵液中IAA含量比优化前提高183.08%。