随着人们对乳、蛋和肉等畜产品的需求不断增长，导致动物对饲料的需求量日益上升[1]。在反刍动物粗饲料中含有较高的木质素，导致动物消化率低，限制了摄入量，并影响动物的生产力[2]。因此，降低木质素含量是提高粗饲料利用率的关键步骤。白腐菌是一种担子菌，可以分泌一系列木质素降解酶，进行复杂木质素大分子和外来物的降解和转化[3]，具有较大应用潜力[4-6]。白腐菌分泌的木质素降解酶由漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（Lip）组成，大多白腐菌可产漆酶和锰过氧化物酶，极少数产木质素过氧化物酶[7]。木质素降解酶的活力直接影响白腐菌对木质素的降解效果，而某些外源因子可提高白腐菌分泌的木质素降解酶活力[8]。目前，关于中药渣在动物生产中的应用研究较多[9]。中药渣是含有多种营养物质以及药物生物活性成分的固体废弃物[10]。将中药渣用于畜禽饲料或饲料添加剂不仅可以促进动物生长发育[11]，调节动物免疫力[12]，还可以减少饲养过程中各类药物的使用，因此在减少环境污染、降低成本和提高食品安全等方面均具有较大的应用潜力[13-14]。因此，本研究采用中药渣作为发酵基质，并对其培养基进行优化，提高菌株木质素降解酶活力，进而提升饲料的利用率。1材料与方法1.1供试材料1.1.1供试菌株本研究中的白腐菌菌株毛栓孔菌XYG422由中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室保藏并提供。1.1.2培养基PDA培养基：去皮马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、VB1 0.02 g/L、琼脂15~20 g/L，121 ℃灭菌25 min备用。固体发酵基础培养基：黄芩药渣20 g/L、玉米粉0.2 g/L、酒石酸铵0.06 g/L、营养液2 mL、蒸馏水10 mL，装入200 mL罐头瓶中，121 ℃灭菌20 min备用。营养液组成：NaH2PO4·12H2O 0.39 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、琥珀酸钠1.18 g/L、FeSO4·7H2O 0.031 5 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、MnSO4·H2O 0.035 g/L、CH3COONa·3H2O 0.408 g/L、CoCl2·6H2O 0.06 g/L、ZnSO4·7H2O 0.028 g/L、CuSO4·5H2O 0.168 g/L、Tween-80 1 mL、维生素B1 10 μg、维生素B2 5 μg、维生素B6 5 μg，pH值自然。1.2方法1.2.1菌种活化培养将菌种接种于PDA平板上，置于30 ℃培养箱中，培养4~5 d进行活化。1.2.2固体发酵培养基组成优化单因素试验1.2.2.1不同碳源对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响在固体发酵基础培养基中，分别用相同含量的葡萄糖、大豆粉、可溶性淀粉替代固体发酵基础培养基中的碳源玉米粉，碳源浓度为0.2 g/L，固体发酵基础培养基中其他成分不变，每瓶中接种3块菌饼，每个处理3个重复。30 ℃培养7 d，分别测定漆酶和锰过氧化物酶，筛选固体发酵的最佳碳源。1.2.2.2不同氮源对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响在基础发酵培养基中，分别采用相同含量的硫酸铵、酵母、蛋白胨和豆饼粉替代固体发酵基础培养基中的氮源酒石酸铵，其他成分不变，每瓶中接种3块菌饼，每个处理3个重复。30 ℃培养7 d，分别测定漆酶和锰过氧化物酶，筛选固体发酵的最佳氮源。1.2.2.3不同碳氮比对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响在上述最佳碳源和氮源的基础上，按照1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1碳氮比配置固体发酵培养基，每瓶中接种3块菌饼，每个处理3个重复。30 ℃培养7 d，分别测定漆酶和锰过氧化物酶，筛选固体发酵的最佳碳氮比。1.2.2.4不同Cu2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响分别设置1、2、3、4 mmol/L四种铜离子浓度梯度配置营养液，加入固体发酵基础培养基，每瓶中接种3块菌饼，每个处理3个重复。30 ℃培养7 d，测定漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，筛选最佳铜离子浓度。1.2.2.5不同Mn2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响分别设置0.2、1.0、1.8、2.6、3.4 mmol/L五种锰离子浓度梯度配置营养液，加入固体发酵基础培养基，每瓶中接种3块菌饼，每个处理3个重复。30 ℃培养7 d，分别测定漆酶和锰过氧化物酶的酶活力，筛选固体发酵的最佳锰离子浓度。1.2.3固体发酵培养基粗酶液的提取固体发酵结束后，每瓶加入25 mL蒸馏水，40 ℃，摇床180 r/min，振荡1 h，将瓶中液体吸出至50 mL离心管中，离心取上清液即为粗酶液。1.2.4固体发酵培养基成分正交试验在单因素试验的基础上，设计正交试验L9(34)，配置不同培养基进行菌株的固体发酵试验，每个处理3个重复。正交试验因素和水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.T001表1正交试验因素和水平水平A碳氮比B Cu2+浓度/(mmol/L)C Mn2+浓度/(mmol/L)11∶110.223∶121.035∶131.81.3酶活力1.3.1锰过氧化物酶使用Solarbio公司生产的锰过氧化物酶试剂盒，按试剂盒使用说明依次加入测定试剂和样品，用分光光度计在465 nm处测定吸光度。1.3.2漆酶采用ABTS法测定漆酶活力，反应体系为2 mL，含pH值4.0酒石酸缓冲液1 mL，蒸馏水0.78 mL、发酵酶液20 mL和ABTS 200 mL，30 ℃水浴1 min，反应30 s，于420 nm处测定吸光度，每组3个重复[15]。1个酶活力单位定义为在当前反应条件下每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量。固体培养时酶活值为总酶活力与干曲质量的比值，单位为U/g。1.4数据统计与分析利用SPSS 17对所得数据进行单因素方差检验，采用Duncan's法进行多重比较。结果以平均值表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同碳源对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响（见图1）由图1可知，在发酵基础培养基中添加不同碳源后，碳源种类对菌株漆酶和锰过氧化物酶活力均具有明显影响。碳源为可溶性淀粉时，菌株漆酶和锰过氧化物酶活力最高，分别为10.98 U/g和49.41 nmol/(min·g)，显著高于碳源为葡萄糖时的酶活力（P0.05）。所以，该培养基的最佳碳源为可溶性淀粉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.F001图1碳源对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.2不同氮源对毛栓孔菌XYG422产木质素分解酶的影响（见图2）由图2可知，氮源种类对菌株锰过氧化物酶和漆酶的影响较大。硫酸铵作为氮源时，毛栓孔菌XYG422漆酶的酶活力和产锰过氧化物酶最大，分别为37.24 U/g和147.15 nmol/(min·g)，显著高于其他氮源时的酶活力（P0.05）。因此，该菌株的最佳氮源为硫酸铵。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.F002图2氮源对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响2.3不同碳氮比对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响（见图3）由图3可知，锰过氧化物酶和漆酶随着碳氮比的增加呈先升后降的趋势，当碳氮比为3∶1时，该菌株锰过氧化物酶和漆酶的酶活力最大，分别为142.4 nmol/(min·g)和36.7 U/g，显著高于其他碳氮比时的酶活力（P0.05）。因此，菌株的锰过氧化物酶和漆酶的最佳碳氮比为3∶1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.F003图3碳氮比对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响2.4Cu2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响（见图4）由图4可知，不同的Cu2+浓度对菌株漆酶活力有一定的影响，但对锰过氧化物酶活力影响不显著（P0.05）。当Cu2+浓度为2 mmol/L时，漆酶活力最大，最大值为34.34 U/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.F004图4Cu2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响2.5Mn2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响（见图5）由图5可知，不同的Mn2+浓度对菌株漆酶和锰过氧化物酶活力均有一定的影响。当Mn2+浓度为1 mmol/L时，漆酶和锰过氧化物酶活力最大，分别为35.07 U/g和170.92 nmol/(min·g)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.F005图5Mn2+浓度对毛栓孔菌XYG422产木质素降解酶的影响2.6正交试验结果正交试验极差分析见表2，方差分析见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.T002表2正交试验极差分析项目A碳氮比B Cu2+浓度/(mmol/L)C Mn2+浓度/(mmol/L)锰过氧化物酶/[nmol/(min·g)]漆酶/(U/g)11∶111.853.4421.3221∶120.266.9928.7031∶131.050.4618.4443∶110.2137.9931.6953∶121.0149.7629.3163∶131.8179.3741.6875∶111.0128.8829.7085∶121.8140.3329.5595∶130.2149.4133.45锰过氧化物酶活力k156.96106.77118.13k2155.71119.03109.70k3139.54126.41124.38R98.7419.6414.68漆酶活力k122.8227.5728.82k234.2329.1929.24k330.9031.1929.89R11.413.621.0710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.018.T003表3正交试验方差分析方差来源偏差平方和自由度均方F值显著性锰过氧化物酶A 碳氮比16 832.4928 416.2447.02*B Cu2+浓度590.502295.251.65C Mn2+浓度325.632162.810.91误差358.012179.00漆酶A碳氮比207.152103.571.61B Cu2+浓度20.32210.160.16C Mn2+浓度2.3321.170.02误差128.60264.30注：F0.05（2，2）=19；F0.01（2，2）=99。由表2可知，优化后的最佳产锰过氧化物酶和漆酶的条件为培养基碳氮比3∶1、Cu2+浓度3 mmol/L、Mn2+浓度1.8 mmol/L。在此条件下，锰过氧化物酶活力为179.37 nmol/(min·g)，漆酶活力为41.68 U/g。由表3可知，培养基碳氮比对毛栓孔菌XYG422产锰过氧化物酶的影响显著（P0.05），同时表3中碳氮比的R值最大，说明培养基碳氮比值的变化对酶活的影响最大。3讨论本研究所用的毛栓孔菌XYG422是1种产木质素降解酶的白腐菌。本研究中，添加碳源可溶性淀粉能够促进T. hirsute XYG422的锰过氧化物酶和漆酶活力。李思等[16]研究表明，在最适的条件下合适的碳源可以提高酶的活力，与本研究结果相同。不同菌种最适有机氮源不同，最适氮源种类和浓度因菌种而异。本研究中，氮源硫酸铵最佳且对菌株的锰过氧化物酶和漆酶影响很大。前期研究认为，NH4+有助于Pleurotus sp.和Cerrena unicolor生产[17-18]。本研究发现，硫酸铵对毛栓孔菌漆酶和锰过氧化物酶活力均具有明显促进作用。漆酶活力和产量等皆受Cu2+影响[8,19]。物种乃至菌株的不同，漆酶活力的最适Cu2+浓度也不相同[20]。在单因素试验中考察了不同Cu2+浓度对菌株产锰过氧化物酶和漆酶活力的影响，其中2 mmol/L Cu2+菌株的漆酶活力最大，为34.34 U/g，但其对菌株的锰过氧化物酶活力影响不大。Mn2+是另一种漆酶和锰过氧化物酶活力的强力诱导剂，不同的物种和菌株具有不同的适宜Mn2+诱导浓度[21]。本研究中，当Mn2+浓度为1 mmol/L时，毛栓孔菌XYG422的漆酶和锰过氧化物酶活力最大，分别为35.07 U/mL和170.92 nmol/(min·g)。本研究中，Cu2+和Mn2+浓度均能够影响毛栓孔菌XYG422产锰过氧化物酶和漆酶活力。但真菌物种间或种内的产酶特性可能存在明显差异[22]。刘海宇等[8]研究发现，奶油栓孔菌漆酶活力远高于锰过氧化物酶活力，未检测到木质素过氧化物酶活力。Andriani等[23]发现，毛栓孔菌可以产3种木质素降解酶，但锰过氧化物酶活力高于木质素过氧化物酶和漆酶，木质素过氧化物酶最低。而本研究正交试验中所用培养基碳氮较为充足，Cu2+浓度3 mmol/L、Mn2+浓度1.8 mmol/L条件下，锰过氧化物酶活力为179.37 nmol/(min·g)，漆酶活力为41.68 U/g。锰过氧化物酶活力远高于漆酶活力，可能是产酶特性导致毛栓孔菌产锰过氧化物酶活力较高，漆酶较低。编码木质素过氧化物酶的基因多为诱导型[24]，可能是未检测到木质素过氧化物酶活力的原因。4结论本研究以黄芩药渣废弃物为基质，以锰过氧化物酶和漆酶为指标，通过单因素试验和正交试验对其发酵基组成进行优化。毛栓孔菌XYG422固体发酵产木质素降解酶的最佳培养基组成为培养基碳氮比3∶1、Cu2+浓度3 mmol/L、Mn2+浓度1.8 mmol/L。在此条件下培养毛栓孔菌，锰过氧化物酶和漆酶活力均得到显著提高。本研究提升了毛栓孔菌XYG422在黄芩药渣固体发酵产物中的产木质素降解酶活力，获得最佳的发酵配方和工艺。利用黄芩药渣发酵白腐菌产木质素降解酶，既可以解决药渣对环境的危害，又可以提高经济效益，具有广阔的应用前景。