长期不规范滥用、过度使用抗生素会导致细菌出现耐药性，并造成药物残留[1]，危害畜禽和人类健康，因此需要寻找抗生素替代品[2]。丁酸梭菌又名酪酸梭菌（Clostridium butyricum），芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，严格厌氧菌。丁酸梭菌能够适应动物肠道的无氧环境，增殖速度快，代谢产物为丁酸、乙酸等短链脂肪酸，可改善肠道健康。研究表明，丁酸梭菌可以改善动物的生长性能和免疫力[3]；补充丁酸衣原体或与酿酒酵母的混合物可以增加泌乳奶牛的乳脂含量[4]。研究表明，有效剂量的丁酸梭菌补充剂（0.05%）可改善热应激山羊的瘤胃发酵功能和生长性能[5-6]。也有研究表明，补充0.1%丁酸梭菌可以提高断奶仔猪的平均日增重[7]，抑制病原微生物繁殖，促进肠道健康[8]。丁酸梭菌能够减轻肠炎沙门氏菌（S. enteritidis）引起的雏鸡肝脏、脾脏和盲肠的组织学病变，恢复肠炎链球菌引起的上皮缺氧，提高肠道菌群的稳定性，抑制沙门氏菌增殖[9]。据报道，日粮补充丁酸梭菌可以提高蛋鸡免疫功能，增强抗氧化能力，调节蛋鸡生产后期盲肠菌群结构，从而改善产蛋性能和蛋品质[10]。因此，本试验选用广西灵山土鸡作为试验动物，探讨丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对灵山土鸡生长性能、血清生化、血常规指标、免疫功能以及肠道形态方面的影响，为复合益生菌替代抗生素在家禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料丁酸梭菌（活菌数≥1×109 CFU/g）购自湖北蓝谷中微生物技术有限公司。复合益生菌（枯草芽孢杆菌≥4.5×109 CFU/g、丁酸梭菌≥2.0×108 CFU/g）购自北京科为博生物科技有限公司。试验动物为广西壮族自治区地方特色品种“灵山土鸡（慢速1.0型）”。基础日粮符合NRC（1994）《家禽营养标准》[11]的营养需要。基础日粮由横县漓源饲料有限公司提供，其营养水平由桂林漓源饲料总公司化验室检测。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.000玉米46.291代谢能/(MJ/kg)14.115小麦15.000粗蛋白/%20.100木薯块1.016粗纤维/%2.625豆粕26.290粗灰分/%6.387玉米蛋白粉5.000粗脂肪/%2.652石粉1.600钙/%1.000磷酸氢钙Ⅲ1.776总磷/%0.759蛋氨酸0.242总赖氨酸/%1.300赖氨酸70%0.383总蛋氨酸/%0.520L-苏氨酸0.212总胱氨酸/%0.326氯化胆碱0.100总色氨酸/%0.210食盐0.100总苏氨酸/%0.936木聚糖酶0.020精氨酸/%1.130β-甘露聚糖酶0.010总缬氨酸/%0.929葡聚糖酶0.010预混料1.950注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 14 000 IU、VD3 7 329.6 IU、VE 56.223 9 IU、VK 6 mg、VB1 3 mg、VB2 9 mg、VB6 6 mg、VB12 0.03 mg、生物素0.15 mg、烟酸60 mg、泛酸18 mg、叶酸1.5 mg、Mn 80 mg、Cu 8 mg、Fe 60 mg、Se 0.3 mg、I 0.8 mg、Zn 50 mg、Co 0.4 mg。2.营养水平均为计算值。1.2试验设计选取同日龄孵化，体重相近，健康程度一致的鸡苗810只，公、母各半。采用完全随机原则将公鸡分为3组即CON公、CB公、CSB公，每组3个重复，每个重复45只；将母鸡分为3组即CON母、CB母、CSB母，每组3个重复，每个重复45只。试验期24 d，试验期间按照养殖场现有饲养管理规章进行。人工投喂饲料，采取限量饲喂模式，每日7：00、19：00各饲喂1次，根据日龄调整饲喂量。自由饮水，试验前7 d饮用水采取煮沸消毒法，由管线输送至小型水塔冷却后进入栏舍使用。鸡舍温度控制在32~35 ℃，随着日龄增长逐渐恢复至室温。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能在试验开始前13 h，试验鸡空腹称重，每组每次抽取公、母各10只计算平均体重，重复6次，计算试验鸡的平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2血清生化及血常规指标24日龄时，每组公、母各随机抽取6只鸡翅下静脉采血1.5 mL，生化管采血3.5~5.0 mL。采血管使用冰袋4 ℃下低温保存，生化管血液3 500 r/min离心10 min制成血清，-80 ℃保存。血清生化及血常规指标均由广西国际壮医医院明秀分院检测。血清生化指标包括：总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、葡萄糖。血常规指标包括：白细胞、红细胞、血红蛋白、血细胞比容、红细胞平均体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白质量浓度、血小板、红细胞分布宽度等。免疫指标包括：免疫球蛋白G、免疫球蛋白M。1.3.3肠道形态每组公、母随机抽取6只鸡，采样前均保持空腹状态，颈部动脉放血处死，分离开腹检查腹腔肠道形态，使用注射器均匀滴注生理盐水100 mL，分离肠道各部分，选取同一位置的肠道（十二指肠、回肠、空肠）样本进行苏木精-伊红（HE）染色。所有肠段均使用生理盐水冲洗后于2 mL离心管保存，固定48 h，取出，用蜡浸泡，包埋，切片，染色，封片，显微镜下40、200倍视野下观察。使用Image pro plus软件对切片图像进行处理，导出肠道绒毛高度、隐窝深度、黏膜层厚度和肠壁厚度数据。1.4数据统计与分析数据采用Excel 2019进行初步整理，SPSS 22.0进行单因素因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合益生菌对灵山土鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，各组灵山土鸡生长性能差异均不显著（P0.05）。CB组公鸡末重高于CSB组、CON组（P0.05）；CSB组母鸡料重比高于CON组和CB组，差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T002表2复合益生菌对灵山土鸡生长性能的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡初重/(g/只)33.2533.2633.200.030.652末重/(g/只)270.48270.55269.555.570.99平均日增重/[g/(只·d)]9.889.899.850.230.991平均日采食量/[g/(只·d)]18.7018.7018.70——料重比1.881.891.900.080.763母鸡初重/(g/只)33.1933.2133.240.050.742末重/(g/只)251.53252.18239.855.370.221平均日增重/[g/(只·d)]9.109.128.610.220.217平均日采食量/[g/(只·d)]16.0018.7018.70——料重比1.761.751.860.190.092注：“—”表示无此数据。2.2复合益生菌对灵山土鸡血液指标的影响2.2.1复合益生菌对灵山土鸡血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，CB组公鸡总胆固醇、高密度脂蛋白含量显著高于CON组、CSB组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T003表3复合益生菌对灵山土鸡血清生化指标的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡总蛋白/(g/L)36.7036.4338.681.470.514白蛋白/(g/L)11.7712.8212.570.400.192球蛋白/(g/L)24.9326.6826.121.930.810白球比0.470.520.480.030.537总胆固醇/(mmol/L)3.44b4.33a3.50b0.210.014甘油三酯/(mmol/L)0.981.151.280.110.191高密度脂蛋白/(mmol/L)2.06b2.58a2.06b0.140.026低密度脂蛋白/(mmol/L)0.630.860.690.070.089葡萄糖/(mmol/L)14.6216.1315.401.070.618母鸡总蛋白/(g/L)37.5034.9535.031.670.487白蛋白/(g/L)10.8811.4010.610.390.378球蛋白/(g/L)26.6223.5524.421.750.461白球比0.430.480.460.040.739总胆固醇/(mmol/L)2.422.622.430.240.793甘油三酯/(mmol/L)1.551.011.210.170.104高密度脂蛋白/(mmol/L)1.571.451.310.130.115低密度脂蛋白/(mmol/L)0.670.480.560.070.163葡萄糖/(mmol/L)14.8514.7814.020.810.728注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2.2复合益生菌对灵山土鸡血常规指标的影响（见表4）由表4可知，CSB组公鸡平均血红蛋白浓度显著低于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T004表4复合益生菌对灵山土鸡血液常规指标的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡白细胞/(×109/L)185.27191.50169.6022.630.783红细胞/(×1012/L)2.272.192.090.200.814血红蛋白/(g/L)79.3374.0068.176.200.463血细胞比容/%29.6028.8327.302.490.804红细胞平均体积/fL130.47131.72131.581.160.711平均血红蛋白含量/pg34.9733.7833.020.640.129平均血红蛋白浓度/(g/L)267.67a256.50ab250.83b3.400.011血小板/(×109/L)1.001.501.000.200.152红细胞分布宽度/%10.0010.6710.500.280.237母鸡白细胞/(×109/L)178.54136.55156.7611.920.074红细胞/(×1012/L)2.272.282.340.080.781血红蛋白/(g/L)72.6773.7574.172.420.903血细胞比容/%28.1528.1829.200.860.626红细胞平均体积/fL124.20123.73108.389.410.422平均血红蛋白含量/pg32.0832.4031.800.830.877平均血红蛋白浓度/(g/L)258.00262.00254.333.610.350血小板/(×109/L)1.171.501.830.410.532红细胞分布宽度/%10.009.2510.330.330.0962.2.3复合益生菌对广西灵山土鸡免疫指标的影响（见表5）由表5可知，CSB组公鸡免疫球蛋白M含量极显著高于CON组（P＜0.01）；CB组、CSB组母鸡免疫球蛋白M含量极显著低于CON组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T005表5复合益生菌对灵山土鸡血清免疫指标的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡免疫球蛋白G0.110.120.110.010.702免疫球蛋白M0.98B1.27AB1.43A0.080.004母鸡免疫球蛋白G0.120.110.100.010.145免疫球蛋白M1.28A0.90B0.99B0.080.007g/L2.3复合益生菌对灵山土鸡肠道形态的影响2.3.1复合益生菌对灵山土鸡十二指肠形态的影响（见表6）由表6可知，CB组、CSB组公鸡、母鸡十二指肠的绒毛高度均高于CON组（P0.05），母鸡十二指肠隐窝深度低于CON组（P0.05），公鸡、母鸡十二指肠的绒隐比均高于CON组（P0.05），母鸡十二指肠黏膜层厚度、肠壁厚度均低于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T006表6复合益生菌对灵山土鸡十二指肠肠道形态的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡绒毛高度/mm1.261.491.400.090.339隐窝深度/mm0.200.220.160.020.156绒隐比6.416.968.801.050.131黏膜层厚度/mm1.641.761.500.080.301肠壁厚度/mm1.81.931.680.070.395母鸡绒毛高度/mm1.251.331.360.130.536隐窝深度/mm0.270.220.250.020.546绒隐比4.695.935.450.450.311黏膜层厚度/mm1.681.661.620.130.738肠壁厚度/mm1.891.881.810.130.6692.3.2复合益生菌对灵山土鸡空肠形态的影响（见表7）由表7可知，CB组、CSB组母鸡空肠绒隐比高于CON组(P0.05)，CB、CSB组母鸡隐窝深度显著高于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T007表7复合益生菌对灵山土鸡空肠肠道形态的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡绒毛高度/mm0.661.010.820.120.443隐窝深度/mm0.170.210.150.020.546绒隐比4.035.005.580.630.105黏膜层厚度/mm1.021.250.880.130.532肠壁厚度/mm1.191.451.070.130.593母鸡0.680.810.740.100.634绒毛高度/mm0.220.190.150.030.098隐窝深度/mm3.04b4.40a5.24a0.670.041绒隐比0.841.061.010.120.342黏膜层厚度1.031.261.180.120.4022.3.3复合益生菌对灵山土鸡回肠形态的影响（见表8）由表8可知，CB组、CSB组母鸡回肠绒毛高度高于CON组，绒隐比值高于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.007.T008表8复合益生菌对灵山土鸡回肠肠道形态的影响项目CON组CB组CSB组SEMP值公鸡绒毛高度/mm0.430.410.440.070.929隐窝深度/mm0.130.120.130.030.948绒隐比3.453.533.380.340.883黏膜层厚度/mm0.590.540.610.110.915肠壁厚度/mm0.770.720.780.110.975母鸡绒毛高度/mm0.460.470.700.110.275隐窝深度/mm0.140.160.200.020.131绒隐比2.993.223.400.420.791黏膜层厚度/mm0.640.650.940.130.237肠壁厚度/mm0.800.831.170.140.2043讨论3.1复合益生菌对灵山土鸡生长性能的影响平均日增重、平均采食量和料重比等是衡量动物生长性能的重要指标[12-13]。研究表明，日粮中添加丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌等益生菌能够改善鸡的生长性能[14-16]，可能是丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌类益生菌能够竞争性抑制病原微生物在肠道中定植，促进有益菌繁殖，改善肠道的微生态环境，提高营养物质的吸收利用率。本试验发现，日粮中添加丁酸梭菌和复合菌对灵山土鸡的生长性能无显著影响，但总体呈提高趋势，可能与限饲导致能量不足有关。日粮中添加复合益生菌和丁酸梭菌不会对灵山土鸡的生长性能产生不利影响，表明了这两种添加剂应用于生产实践中的可行性。3.2复合益生菌对灵山土鸡血液指标的影响血清生化指标可以反映动物机体生理状态。Zhang等[17]发现，日粮中添加丁酸梭菌对改善肉鸡甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均无显著效果。本试验发现，单独使用丁酸梭菌组（CB组）公鸡血清总胆固醇、高密度脂蛋白含量显著高于其他组，原因可能是多种益生菌寄生宿主体内消耗了机体更多能量，从而导致了血脂指标数值的下降，表明多种益生菌的组合比起单独使用某种益生菌对机体健康更有利。Liu等[18]研究发现，与饲喂基础日粮相比，日粮添加200 mg/kg丁酸梭菌（2.0×109 CFU/kg）对肉鸡血清甘油三酯含量并无显著改善作用，但添加400、600 mg/kg丁酸梭菌可以显著降低肉鸡血清甘油三酯含量，表明益生菌添加量对机体血脂代谢相关指标具有影响。血液中的白细胞、红细胞数目以及血红蛋白浓度是评价动物机体状况的重要指标，其承担着关键的生理功能。有研究表明，使用丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对肉鸡血液中红细胞、白细胞无影响[19-20]。本试验中，复合菌处理组（CSB组）公鸡血液平均血红蛋白浓度显著低于CON组，原因是益生菌可以加强肉鸡总体免疫功能，提升血液蛋白水平[21]。研究发现，饲粮中添加丁酸梭菌能够增强大肠杆菌K88感染肉雏鸡血清免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M含量[22-23]。本试验中，复合菌处理组（CSB组）公鸡免疫球蛋白M含量明显增加，表明添加益生菌可以有效提升血液抗体蛋白含量，改善雏鸡机体免疫力，提高生长性能[24]。3.3复合益生菌对广西灵山土鸡肠道形态的影响研究发现，丁酸梭菌等益生菌可通过丁酸等代谢产物为肠道细胞发育提供能量和营养物质，促进肠道上皮细胞的发育和修复[25-26]。益生菌能够维护肠道形态，在家禽日粮中添加丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌能显著提高肠道各肠段的绒毛高度和绒/隐比[27-29]。本试验结果发现，CB和CSB组公鸡、母鸡十二指肠的绒毛高度优于CON组，绒隐比高于CON组。有研究也显示，使用丁酸梭菌处理的雏鸡空肠和回肠绒毛更长，绒隐比增高[14,30]。绒毛高度的增加导致肠道吸收表面积增加，刺激了肠道消化酶的分泌，从而提高了营养的消化吸收利用率[31]。4结论本试验表明，日粮中添加复合益生菌和丁酸梭菌对灵山土鸡生长性能具有提高的趋势。复合菌处理组增加了肠道绒毛高度和绒隐比，显著增加了血清IgM含量，且日粮中添加复合益生菌的效果略优于单一菌丁酸梭菌。