羊草在呼伦贝尔草原、科尔沁草原、锡林郭勒草原等地广为分布，是我国唯一出口的本土草，具有高蛋白、抗寒、耐盐碱、耐瘠薄、耐牧、寿命长等优点，同时具有发达的横走根茎。将羊草用于草地扩繁能够有效发挥饲草供给和生态保护功能[1-2]。传统的羊草利用方式为放牧或者刈割后调制干草。近年来，禁牧政策的实施促使牧民们通过刈割调制干草后进行饲喂和贮藏，但由于草原气候多变，在干草调制过程中很容易遭受雨淋等极端天气的影响，造成营养物质和饲草资源的损失，于是羊草青贮应运而生[3]。科学合理的青贮能够有效保留牧草中的营养成分，实现长期保存和远程运输的目的，保障国家安全饲草贮备。在青贮发酵过程中，葡萄糖、蔗糖和果糖等糖类物质是重要的发酵底物。乳酸菌利用这些糖类物质进行生长繁殖，产生乳酸，推动青贮发酵进程[4]。乳酸菌具有不同的发酵类型，同型发酵乳酸菌是通过糖酵解途径将一分子的葡萄糖或者果糖发酵转换成两分子的乳酸[5-6]。异型发酵乳酸菌是通过戊糖磷酸化途径将一分子的葡萄糖发酵转换成一分子的乳酸和一分子的二氧化碳和乙酸或者乙醇[7-8]。大量研究表明，添加可溶性糖类物质能够促进乳酸菌发酵，有效提高青贮效果，但根据发酵底物和发酵类型的不同，乳酸菌发酵产生的乳酸和乙酸含量也会不同。乳酸是青贮发酵过程中的重要产物，能够快速降低青贮饲料的pH值，从而抑制有害菌的生长繁殖。乙酸具有抑菌的功能，可以通过直接抑制酵母和霉菌来提高青贮饲料的品质和有氧稳定性[9-11]。目前的研究主要集中于不同类型添加剂对青贮品质的影响，对糖类添加剂的作用效果及对有氧稳定性的影响研究较少。本试验设置葡萄糖、蔗糖和果糖3种可溶性糖作为添加剂，分析其对羊草青贮品质、有氧稳定性和微生物数量的影响，以期为添加糖类青贮提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验所用的羊草品种为吉生1号，种植于内蒙古自治区通辽市内蒙古民族大学试验基地。试验地气候类型为温带大陆性季风气候，土地类型为沙化草地，地理坐标为122°11'E、43°59'N。1.2试验设计羊草青贮处理设置为对照组（CK组）、葡萄糖组（G组）、蔗糖组（S组）、果糖组（F组）。羊草青贮原料于2021年6月24日抽穗期刈割，用铡刀切碎至2 cm，取300 g不同糖类（纯度为99.5%，添加量为2% FW，由天津市鑫铂特化工有限公司提供），混匀装填到25 cm × 36 cm的聚乙烯袋内。控制青贮含水量在65%左右，每个处理设置3个重复。抽真空封口后置于室温（25 ℃）保存。青贮发酵60 d后开袋取样，将剩余样品转移到1 L的聚乙烯无菌瓶内进行有氧暴露，在有氧暴露8 d取样，在室温（25 ℃）下测定羊草青贮60 d和有氧暴露8 d的各项指标。1.3测定指标及方法1.3.1营养指标将样品放置在105 ℃的烘箱内杀青15 min，再放置在65 ℃的烘箱内烘干48 h至恒重，粉碎。采用GB/T 6435—2006干燥法测定干物质（DM）的含量；凯氏定氮法测定粗蛋白质（CP）的含量[12]；ANKOM（XT15i）自动脂肪分析仪测定粗脂肪（EE）的含量；ANKOM（A2000i）纤维分析仪测定酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）的含量；蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物（WSC）的含量[13]。1.3.2发酵品质羊草青贮开袋后取10 g样品，加入90 mL蒸馏水，使用均质拍打仪匀速拍打2 min，过滤得到浸提液。采用酸度计（ST3100）测定pH值；Agilent（1100）高效液相色谱仪测定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）的含量；苯酚-次氯酸比色法测定氨态氮（NH3-N）的含量[14]。1.3.3有氧稳定性羊草青贮开袋后转移至1 L的无菌瓶中，将多通道数据记录仪（MDL-1048A）的探头插入试样的中心，设置每2 h测定1次温度，记录温度的变化。每个无菌瓶口覆盖两层纱布，避免杂质污染和减少水分蒸发。本试验通过比较青贮饲料中心温度超过室温2 ℃所需要的时间来评估其有氧稳定性[15]。1.3.4微生物计数羊草青贮开袋后，取10 g样品，加入90 mL无菌水，使用均质拍打仪匀速拍打2 min，过滤得到菌液。采用MRS培养基培养乳酸菌；马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养霉菌和酵母菌；营养琼脂培养基培养好气性细菌；伊红美兰培养基培养大肠杆菌，使用平板计数法对微生物数量进行计数。1.4数据统计与分析采用Excel 2010对试验原始数据进行处理和表格制作，图片由Graphpad prism 8.0.2制成，采用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1羊草原料营养成分和微生物组成（见表1）由表1可知，羊草的干物质含量为33.56%FW，粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为11.96%DM、5.08%DM、69.15%DM、39.13%DM；乳酸菌、好气性细菌、大肠杆菌和酵母菌的数量为1.65、2.53、1.04、1.59 lgCFU/g，未检测到霉菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.018.T001表1羊草原料营养成分和微生物组成项目含量干物质/%FW33.56粗蛋白质/%DM11.96可溶性碳水化合物/%DM5.08中性洗涤纤维/%DM69.15酸性洗涤纤维/%DM39.13乳酸菌/lgCFU/g1.65好气性细菌/lgCFU/g2.53大肠杆菌/lgCFU/g1.04酵母菌/lgCFU/g1.59霉菌/lgCFU/gND注：ND表示未检出；下表同。2.2糖类对羊草青贮营养成分的影响（见表2）由表2可知，青贮60 d时，糖类组羊草的干物质含量显著高于CK组（P0.05）；有氧暴露8 d时，糖类组羊草的干物质含量均显著降低（P0.05），S组和CK组羊草的干物质含量显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的粗蛋白含量显著高于CK组（P0.05）；有氧暴露8 d时，糖类组羊草的粗蛋白含量均显著降低（P0.05），S组和CK组羊草的粗蛋白含量显著高于其他处理组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.018.T002表2糖类对羊草青贮营养成分的影响组别干物质/%FW粗蛋白质/%DM可溶性碳水化合物/%DM中性洗涤纤维/%DM酸性洗涤纤维/%DM青贮60 dCK组30.14±0.36Ba13.04±0.26Ba1.28±0.09Ca63.08±0.28Ab36.97±0.22AbG组32.04±0.53Aa14.19±0.60Aa2.05±0.02Ba61.20±1.18ABb36.77±0.23ABbS组33.12±1.13Aa14.62±0.20Aa2.84±0.15Aa56.73±1.23Cb34.82±1.45CbF组32.67±1.22Aa14.18±0.53Aa2.16±0.21Ba59.81±1.90Bb35.28±0.78BCb有氧暴露8 dCK组29.61±1.17Aa12.88±0.06Aa0.92±0.02Db69.33±0.17Aa40.75±0.30AaG组28.02±0.39Bb11.41±0.29Cb1.37±0.01Cb68.40±0.50Aa40.55±0.08AaS组29.67±0.35Ab13.27±0.12Ab1.96±0.13Ab63.37±0.92Ca39.42±0.50BaF组28.74±0.28ABb12.20±0.46Bb1.66±0.06Bb66.77±0.55Ba39.52±0.21Ba注：不同大写字母表示不同处理在同一时间显著差异（P0.05）；不同的小写字母表示相同处理在不同时间差异显著（P0.05）；下表同。青贮60 d时，糖类组羊草的可溶性碳水化合物含量显著高于CK组（P0.05），S组羊草的可溶性碳水化合物含显著高于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组羊草的可溶性碳水化合物含量均显著降低（P0.05），糖类组显著高于CK组（P0.05），S组显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，S组羊草的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著低于其他处理组（P0.05），CK组显著高于S组（P0.05）；有氧暴露8 d时，G组和CK组羊草的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著高于其他处理组（P0.05）。2.3糖类对羊草青贮发酵品质的影响（见表3）由表3可知，青贮60 d时，糖类组羊草的pH值显著低于CK组（P0.05），有氧暴露8 d时，糖类组羊草的pH值均显著上升（P0.05），且显著高于CK组（P0.05），G组羊草的pH值显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的乳酸含量显著高于CK组（P0.05），S组显著高于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组羊草的乳酸含量均显著下降（P0.05），糖类组羊草的乳酸含量显著低CK组（P0.05），G组和F组显著低于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的乙酸含量显著高于CK组（P0.05），S组羊草的乙酸含量显著高于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组羊草的乙酸含量均显著下降（P0.05），糖类组羊草的乙酸含量显著低于CK组的（P0.05），G组显著低于其他各处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的丙酸含量显著高于CK组（P0.05），S组显著高于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组的丙酸含量均显著下降（P0.05），糖类组羊草的丙酸含量显著高于CK组（P0.05），S组显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，未检测到丁酸；有氧暴露8 d时，G组和F组羊草的丁酸含量显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的NH3-N含量显著低于CK组（P0.05），S组显著低于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组的NH3-N含量均显著上升（P0.05），G组羊草的NH3-N含量显著高于其他处理组（P0.05），S组和CK组羊草的NH3-N含量显著低于其他处理组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.018.T003表3糖类对羊草青贮发酵品质的影响组别pH值乳酸/(g/kg)乙酸/(g/kg)丙酸/(g/kg)丁酸/(g/kg)氨态氮/(%TN)青贮60 dCK组4.55±0.02Aa19.48±0.04Da8.31±0.27Da1.45±0.04DaND0.56±0.07AbG组3.82±0.04Bb37.69±0.51Ca16.08±0.34Ca3.68±0.15CaND0.44±0.03BbS组3.74±0.02Cb40.56±0.42Aa17.83±0.04Aa5.00±0.06AaND0.30±0.04CbF组3.80±0.06BCb38.35±0.22Ba16.65±0.18Ba4.17±0.18BaND0.43±0.03Bb有氧暴露8 dCK组5.30±0.04Da15.10±0.22Ab2.96±0.04Ab0.46±0.07Db0.05±0.02B0.81±0.01CaG组6.83±0.04Aa10.36±0.43Cb1.51±0.17Db1.13±0.06Cb0.14±0.02A1.02±0.07AaS组6.19±0.15Ca12.09±0.10Bb2.63±0.08Bb1.58±0.08Ab0.08±0.02B0.84±0.03CaF组6.43±0.05Ba10.73±0.07Cb2.17±0.15Cb1.43±0.04Bb0.12±0.03A0.93±0.04Ba2.4糖类对羊草青贮有氧稳定性的影响（见图1）由图1可知，CK组羊草青贮有氧暴露80 h后超过室温2 ℃，有氧稳定性显著高于其他处理组（P0.05），G组羊草青贮有氧暴露44 h后超过室温2 ℃，有氧稳定性显著低于其他处理组（P0.05），S组有氧暴露56 h后超过室温2 ℃，有氧稳定性显著高于F组（P0.05），F组有氧暴露50 h后超过室温2 ℃，有氧稳定性显著高于G组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.018.F001图1糖类对羊草青贮有氧稳定性的影响2.5糖类对羊草青贮微生物数量的影响（见表4）由表4可知，青贮60 d时，S组的乳酸菌数量显著高于其他处理组（P0.05），糖类组羊草的乳酸菌数量显著高于CK组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组的乳酸菌数量均显著下降（P0.05），糖类组羊草的乳酸菌数量显著低于CK组（P0.05），G组和F组羊草的乳酸菌数量显著低于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的酵母菌数量显著低于CK组（P0.05），S组羊草的酵母菌数量显著低于其他处理组（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组的酵母菌数量均显著上升（P0.05），糖类组羊草的酵母菌数量显著高于CK组（P0.05），G组羊草的酵母菌数量显著高于其他处理组（P0.05）。青贮60 d时，糖类组羊草的好气性细菌数量显著低于CK组（P0.05），S组和F组的好气性细菌数量显著低于其他处理（P0.05）；有氧暴露8 d时，各处理组的好气性细菌数量均显著上升（P0.05），糖类组羊草的好气性细菌数量显著高于CK组（P0.05）。青贮60 d时，未检测到霉菌；有氧暴露8 d时，糖类组羊草的霉菌数量显著低于CK组（P0.05），G组和F组羊草的霉菌数量显著高于其他处理（P0.05）。青贮60 d和有氧暴露8 d，均未发现大肠杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.018.T004表4糖类对羊草青贮微生物数量的影响组别乳酸菌酵母菌好气性细菌霉菌大肠杆菌青贮60 dCK组6.09±0.04Ca4.60±0.02Ab4.65±0.03AbNDNDG组6.52±0.03Ba4.49±0.02Bb4.55±0.03BbNDNDS组6.63±0.02Aa4.35±0.04Db4.45±0.02CbNDNDF组6.54±0.01Ba4.43±0.02Cb4.49±0.02CbNDND有氧暴露8 dCK组4.53±0.04Ab6.32±0.04Da6.53±0.04Ca1.52±0.07CNDG组4.19±0.08Cb6.69±0.02Aa6.80±0.02Aa3.96±0.12ANDS组4.41±0.08Bb6.53±0.04Ca6.72±0.03Ba3.63±0.13BNDF组4.18±0.04Cb6.60±0.03Ba6.77±0.01ABa3.84±0.06ANDlgCFU/g3讨论3.1羊草原料特性分析原料中的乳酸菌和可溶性糖是青贮乳酸发酵的必要条件，两者的含量直接影响青贮品质。大量研究表明，乳酸菌数量高于105、可溶性糖含量高于干物质的5%时青贮效果较好[16-17]。本试验中，羊草青贮原料的乳酸菌数量和可溶性碳水化合物含量分别为1.65 lgCFU/g和5.08%，乳酸菌数量较少，需要使用添加剂促进青贮发酵，抑制好氧性细菌和大肠杆菌等微生物的生长繁殖，保障青贮饲料的营养和发酵品质。3.2糖类对羊草青贮营养成分的影响在青贮发酵初期，植物原料细胞会利用残存的空气进行呼吸作用，分解可溶性糖产生水分和二氧化碳，同时好气性微生物会分解蛋白质和糖类进行生长繁殖，造成部分营养损失[18]。当空气耗尽，进入厌氧发酵阶段后，乳酸菌利用可溶性糖作为底物大量生长繁殖并产生乳酸，乳酸能够快速降低青贮环境的pH值，抑制有害菌的代谢活动，减少营养物质的损失[19]。分析羊草青贮营养成分可知，青贮60 d时，糖类组羊草的干物质、粗蛋白质和可溶性糖的含量高于对照组，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维低于对照组。原因是在青贮过程中发酵前期青贮饲料间隙中存在少量空气，为好气性微生物提供了生长条件，在对照组中梭菌、好气性细菌和酵母菌等会与乳酸菌竞争生存环境和营养，造成营养物质的损失[20]。糖类组通过提供外源的可溶性糖作为乳酸菌发酵的底物，促进了乳酸含量的积累，能够快速形成酸性环境来抑制杂菌的生长，更好地保留营养成分[21]。有氧暴露8 d时，糖类组的干物质、粗蛋白质和可溶性糖含量均降低，酸性洗涤纤维含量上升。原因是糖类组开袋后含有大量的乳酸和可溶性糖，在有氧环境下成为酵母菌和霉菌等有害微生物生长繁殖的底物，二次发酵和有氧变质严重，造成青贮饲料的品质显著下降，危害家畜健康[22-23]。在青贮60 d和有氧暴露8 d时，蔗糖组的营养品质均高于葡萄糖组和果糖组，可能是由于原料上附着的不同乳酸菌在青贮饲料发酵过程中对可溶性糖的利用和转化方式不同，导致青贮品质和有氧稳定性存在差异，与陈梦言等[24]的研究结果一致。3.3糖类对羊草青贮发酵品质的影响在青贮发酵过程中，乳酸积累量和pH值是评价青贮饲料发酵质量的重要指标。厌氧发酵阶段，乳酸菌数量迅速增加，发酵产生大量有机酸，致使杂菌生长活动被抑制甚至死亡，当pH值低于4.2后，青贮饲料发酵到达稳定阶段，品质变化较小[25]。分析羊草青贮发酵品质可知，青贮60 d时，糖类组羊草的乳酸、乙酸和丙酸含量均显著高于对照组，pH值和氨态氮含量显著低于对照组。原因是添加外源可溶性糖提供了更多的发酵底物来推进乳酸菌的发酵进程，从而产生更多的有机酸[26]。在对照组中，糖类含量较少，乳酸菌生长较差，无法很好地抑制梭菌和酵母菌等对蛋白质的分解，蛋白质损失较多导致氨态氮含量上升，影响青贮的发酵品质[27]。有氧暴露8 d时，糖类组的乳酸、乙酸、丙酸含量均显著降低且低于对照组，pH值和氨态氮显著上升，且有丁酸产生。原因是开袋接触空气后糖类组底物充足，乳酸同化酵母菌等好氧微生物生长迅速，有机酸含量下降且pH值上升，蛋白质氧化和分解严重，产生大量的丁酸和氨态氮，导致青贮饲料产生难闻的挥发性气味，严重影响家畜的采食率和适口性[28]。在糖类组中，蔗糖组的发酵指标始终优于葡萄糖组和果糖组，可能是由于蔗糖作为碳源有利于乳酸的产生和乙酸的转化，乳酸在发酵阶段能够快速抑制有害微生物生长，导致青贮品质较好。乙酸在有氧暴露阶段能提高青贮饲料的有氧稳定性，导致有氧变质程度较轻，与李平[29]、Luo等[30]的研究结果一致。3.4糖类对羊草青贮有氧稳定性的影响青贮饲料在有氧暴露期间，好氧微生物通过利用可溶性糖、蛋白质和乳酸等作为底物，分解代谢释放出大量热量，导致青贮饲料的温度迅速上升，通过分析内部温度超过室温2 ℃时所用的时间，对比青贮饲料有氧稳定性[31]。对羊草青贮的有氧稳定性分析可知，在有氧暴露期间，对照组羊草青贮的有氧稳定性最好，糖类组的有氧稳定性显著低于对照组。原因是有氧暴露后添加的可溶性糖成为好氧微生物生长的底物，促进了二次发酵和有氧变质的发生，青贮饲料开袋后更容易变质，可利用时间缩短[32]。在糖类组中，蔗糖组的有氧稳定性较好，葡萄糖组的有氧稳定性最差，可能是由于蔗糖能够作为不同发酵类型乳酸菌的发酵底物，产生较多的乳酸和乙酸，更好地抑制杂菌生长。周斐然等[33]研究指出，甜高粱在有氧暴露环境下更容易发生二次发酵，有氧稳定性较差，与本研究结果一致。3.5糖类对羊草青贮微生物数量的影响微生物的生长代谢是影响青贮饲料在青贮过程中和有氧暴露期间品质的重要因素。青贮过程中乳酸菌数量和有氧暴露期间好氧微生物数量直接影响青贮发酵的效果和青贮饲料的有氧稳定性。青贮饲料的变质会造成饲草资源的浪费，严重危害家畜的健康，因此关注青贮饲料微生物的数量至关重要[34]。对羊草青贮的微生物数量分析可知，青贮60 d时，糖类组羊草的乳酸菌数量显著高于对照组，酵母菌和好气性细菌数量显著低于对照组，蔗糖组的乳酸菌数量显著高于其他处理，酵母菌和好气性细菌数量显著低于其他处理。原因是添加可溶性糖促进了乳酸菌的快速生长，缩小了其他菌的生存空间，蔗糖能够分解为葡萄糖和果糖，有利于不同种类乳酸菌生长[35]。有氧暴露8 d时，糖类组的有害微生物增长较为严重，酵母菌、好气性细菌和霉菌数量显著高于对照组。青贮饲料发生有氧变质会分解大量的营养物质并产生各种难闻的挥发性气味和有毒物质，家畜采食变质的饲料后，其中的毒素会损伤家畜的脏器，抑制免疫机能，导致家畜中毒，甚至死亡，而且毒素会累积存留在畜产品中，严重威胁人类的食品安全[36]。4结论本文通过研究糖类对羊草青贮品质、有氧稳定性和微生物数量的影响发现，在青贮发酵过程中，糖类能够显著提高羊草青贮的营养成分和发酵品质，促进乳酸菌生长，其中添加蔗糖的效果要优于葡萄糖和果糖。在有氧暴露后，糖类会显著降低羊草青贮饲料的有氧稳定性，酵母菌、好气性细菌和霉菌数量显著上升，青贮品质劣变严重。