随着凉茶产业的高速发展，凉茶渣的资源化利用研究也逐渐兴起。凉茶渣可以直接作为饲料原料改善猪肉品质和胴体性状[1]，改善育肥牛空肠绒毛高度、屏障功能[2]。发酵后的凉茶渣能够促进后备奶牛生长发育，提高机体免疫力，增强抗氧化能力[3-4]。微贮后的凉茶渣可以提高热应激状态下育肥牛的采食量和日增重，降低呼吸频率与直肠温度[5]。但是关于凉茶渣的发酵工艺研究依然比较缺乏。黑曲霉发酵后可以产生淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等多种降解基质的酶类[6-9]，降解后的基质转变为果糖、葡萄糖等可溶性单糖以及柠檬酸、葡萄糖酸和氨基酸等小分子有机酸[10-12]；部分物质被进一步代谢为CO2等气体。因为基质的降解率与蛋白质含量正向相关[13]，且柠檬酸等有机酸降低了产物pH值，所以发酵效果可以用降解率[10,13]和产物pH值[10,14]来评价。产朊假丝酵母发酵可以显著提高体系中蛋白质含量，是饲料工业常用菌种之一。因此，本研究探索黑曲霉和产朊假丝酵母联合发酵凉茶渣的最佳工艺，评价产物抗氧化性能，进一步促进凉茶渣的资源化利用。1材料与方法1.1菌株与材料黑曲霉GIM3.562和产朊假丝酵母GIM2.148，购自广东省微生物菌种保藏中心，参照文献[15]进行活化。凉茶渣由加多宝食品饮料公司提供。固态凉茶渣培养基和PDA培养基参照文献[15]制备。固态凉茶渣高压湿热灭菌前、后pH值分别为5.63、5.01。1.2仪器设备5804R台式冷冻离心机（Eppendorf公司），BSA124S电子天平（Sartorius公司），Elx50酶标仪（BioTek Instruments公司），SX-700高压灭菌器（TOMY公司），XS-212生物显微镜（江南光电公司）。1.3试验方法1.3.1单因素试验综合考虑降解率、产物pH值以及工业化生产的便利，参照文献[16]，对氮源（分别添加4%豆粕、氯化铵、尿素、硫酸铵和无补充氮源）、碳源（分别添加2%葡萄糖、蔗糖、糖蜜、α-乳糖和不补充碳源）、含水量（65%、70%、75%、80%、85%）、发酵时间（48、72、96、120、144 h）、浸泡液pH值（5.00、6.00、7.00、8.00、9.00）、温度（室温、28、31、34、37 ℃）进行单因素试验，每组试验重复3次。以不接种菌种的凉茶渣培养基为空白对照。1.3.2正交试验根据单因素试验结果，发现发酵时间越长，降解率越高；含水量从65%升高至80%时，对降解率无显著影响，而产物pH值逐渐降低；当浸泡液pH值大于7.00以后，随浸泡液pH升高，降解率增大。因此，将发酵时间延长至168 h，含水量降低至60%，以探索更宽的时间和含水量范围对发酵工艺的影响。以降解率为考察指标，利用正交试验，优化凉茶渣发酵工艺。L9(34)正交试验因素和水平设计见表1。每组试验重复3次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.T001表1L9（34）正交试验因素和水平设计水平A含水量/%B浸泡液pH值C温度/℃D发酵时间/h1607.0031722708.00341203809.00371681.4降解率和产物pH值产物pH值和降解率参照文献[16]的方法测定。1.5发酵产物水提液抗氧化活性产物的超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率和DPPH自由基清除率参照文献[16]的方法测定。1.6数据统计与分析试验结果采用SPSS 21软件进行方差分析，采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1氮源种类对凉茶渣发酵效果的影响（见图1）由图1可知，与无氮源相比，硫酸铵显著提高了降解率（P0.05）。发酵产物pH值从低到高的氮源依次为豆粕硫酸铵尿素氯化铵，4种氮源之间差异显著（P0.05）。所有发酵组的降解率均远高于空白组降解率，所有发酵组的产物pH值均远低于空白组。由于硫酸铵为氮源时的降解率最高，且产物pH值较低，因此在后续正交试验中选择4%硫酸铵作为氮源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F001图1氮源种类对凉茶渣发酵效果的影响注：空白组不参与方差分析；大写字母不同表示降解率差异显著（P0.05），不同小写字母表示pH值差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下图同。2.1.2碳源种类对凉茶渣发酵效果的影响（见图2）由图2可知，与无碳源相比，糖蜜对产物pH值无显著影响（P0.05），α-乳糖显著提高了产物的pH值（P0.05），葡萄糖和蔗糖显著降低了产物pH值（P0.05）。虽然碳源对凉茶渣降解率无显著影响，但是添加葡萄糖对应的发酵产物pH值最低，因此选择葡萄糖作为后续正交试验的碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F002图2碳源种类对凉茶渣发酵效果的影响2.1.3含水量对凉茶渣发酵效果的影响（见图3）由图3可知，当含水量为85%时降解率最低，显著低于其他含水量时的降解率（P0.05）。当含水量从65%增加到80%时，产物pH值缓慢降低。与75%和80%含水量相比，65%和85%含水量时产物的pH值显著升高（P0.05）。由于新鲜凉茶渣的含水量为79.45%，且当含水量为80%时进行发酵，凉茶渣的降解率较高，产物pH值较低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F003图3含水量对凉茶渣发酵效果的影响2.1.4发酵时间对凉茶渣发酵效果的影响（见图4）由图4可知，凉茶渣的降解率和产物pH值均随时间的延长而逐渐升高。发酵72 h和96 h对降解率无显著影响（P0.05），发酵120 h和144 h对降解率无显著影响（P0.05）；发酵48 h和72 h对产物pH值无显著影响（P0.05），发酵96 h和120 h对产物pH值无显著影响（P0.05）。综合考虑工业化处理效率、产品的防腐性能及适口性，将后续试验的时间设定为72 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F004图4发酵时间对凉茶渣发酵效果的影响2.1.5浸泡液pH值对凉茶渣发酵效果的影响（见图5）由图5可知，浸泡液pH值为5.00、6.00和8.00对凉茶渣的降解率无显著影响（P0.05）；当浸泡液pH值为7.00时，凉茶渣的降解率显著低于其他各pH值条件下的降解率（P0.05）；浸泡液pH值为9.00时，降解率显著升高（P0.05）。当浸泡液pH值从5.00升高到8.00时，对产物pH值均无显著影响（P0.05），而浸泡液pH值为9.00时，产物pH值显著升高（P0.05）。由于用pH值为5.00的浸泡液浸泡后体系的实际pH值和凉茶渣自身的pH值分别为5.58和5.61，二者比较接近。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F005图5浸泡液pH值对凉茶渣发酵效果的影响2.1.6温度对凉茶渣发酵效果的影响（见图6）由图6可知，温度对凉茶渣的降解率无显著影响（P0.05）。与室温相比，28 ℃时对产物pH值无显著影响，31~37 ℃显著升高了发酵产物的pH值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.F006图6温度对凉茶渣发酵效果的影响2.2正交试验结果（见表2、表3）由表2可知，通过R值判断，4个因素对凉茶渣的降解率影响顺序为浸泡液pH值B发酵时间D含水量A温度C。通过k值可以发现，A3B3C2D3为正交试验得出的最优组合，即含水量80%、浸泡液pH值9.00、发酵温度34 ℃、时间168 h是黑曲霉和产朊假丝酵母联合发酵凉茶渣的最佳工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.T002表2L9（34）正交试验极差分析项目ABCD降解率/%X1X2X31123217.3619.2621.102111113.4712.2213.573231221.2222.0922.104222118.2018.0917.755312215.7415.9916.486321320.5920.0921.757333119.2619.6821.008132322.2922.2322.239213317.7514.6312.96k118.1914.7618.5717.03k218.3119.3518.7819.04k318.9521.3418.1119.39R0.766.590.672.36由表3可知，浸泡液pH值和发酵时间对降解率有显著影响，其中浸泡液pH值影响极显著（P0.01），而温度和含水量对降解率无显著影响。4个因素的主次关系为浸泡液pH值时间含水量温度，与极差分析结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.T003表3正交试验差分析项目平方和自由度均方F值P值A3.02121.5111.1350.343B205.4952102.74877.2090.001C2.09021.0450.7850.471D29.280214.64011.0010.001误差23.950181.330注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。经过验证，凉茶渣最佳工艺条件下的降解率为23.87%，高于所有单因素试验和正交试验中的降解率，此时产物pH值为3.98。2.3发酵产物水提液抗氧化活性（见表4）由表4可知，当发酵产物水提液质量浓度为6、12、24 g/L时，显著降低了对应浓度发酵产物的超氧自由基清除率；极显著提高了羟基自由基清除率；而DPPH自由基清除率始终保持84%左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.017.T004表4发酵产物水提液抗氧化活性项目浓度/(g/L)超氧阴离子自由基/%羟基自由基/%DPPH自由基/%发酵前[16]637.73±1.63b—81.99±0.91b1243.01±0.89a6.29±1.07e81.49±2.69b2443.56±1.25a47.06±5.53c90.71±3.92a发酵后6—29.00±7.09d84.89±1.22b12—66.09±0.30b84.32±0.59b2428.65±3.46c80.46±6.87a82.06±1.18b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；“—”表示未检出。3讨论黑曲霉和酵母菌联合发酵具有协同作用。谭显东等[17]发现，黑曲霉和酵母菌的相互作用对发酵三七渣生产蛋白具有显著影响。黑曲霉和酵母菌在联合发酵甜高粱酒糟生产蛋白饲料[18]、发酵牦牛血制备可溶性蛋白[19]、发酵橙子皮生产果胶酶[20]等方面均表现出协同作用。菌种在快速生长前期，对大分子营养的分解速率高于自身对小分子营养物质的消耗速率[14]，导致有机酸等小分子物质积累较多，使产物pH值下降。此时，由于基质发酵不完全，致使基质的降解率偏低；而在快速生长后期及稳定期需要更多的小分子营养物质，于是将生成的小分子有机酸作为碳源消耗，使产物pH值升高，基质的降解率同时增大。因此，凉茶渣的降解率和产物pH值随时间延长而呈现同时增大的现象。在利用黑曲霉发酵三七渣生产蛋白的过程中，发现基质降解速率在0~72 h内增加较快，而72 h后较慢，而且产物pH值在0~60 h内降低，而60 h后开始缓慢升高[14]。由于本研究从48 h开始考察时间对凉茶渣的降解率和产物pH值的影响，因此没有观察到发酵前期降解率随时间延长而增大、pH值随时间延长而降低的现象，仅观察到发酵后期降解率和pH值均随时间延长而增大的现象。原因可能是在28 ℃时，温度相对较低，黑曲霉和产朊假丝酵母生长速率均较小，当发酵48 h甚至72 h时，黑曲霉和产朊假丝酵母依然处于快速生长前期，致使更多的有机酸累积，从而使凉茶渣的降解率和产物pH值均较低。同理，与硫酸铵、氯化铵和尿素相比，豆粕和无氮源不利于黑曲霉和酵母菌的增殖和生长[21]，致使在相同的发酵时间内（72 h），累积了较多的有机酸，导致凉茶渣的降解率和产物pH值均较低。4结论本研究发现，含水量80%、浸泡液pH值9.00、温度34 ℃、时长168 h是黑曲霉和产朊假丝酵母联合发酵凉茶渣的最佳工艺，此时凉茶渣的降解率和产物pH值分别为23.87%和3.98，且产物具有较高的抗氧化活性；但由于生产实际情况，正交试验因素水平的选择上存在一定的局限性，未来将进一步优化生产工艺。