伴随着全球气候变暖逐渐加剧，畜禽养殖集约化，畜禽自身会产生热应激反应[1-2]，导致其采食量下降，继而降低畜禽产品品质[3]，直接影响养殖企业的经济效益。热应激产生的原因是活性氧代谢物在细胞内积累过多，引起细胞破坏，继而增加热休克蛋白（HSP）含量[4]。研究表明，香薷能够有效地改善热应激对大鼠抗氧化功能的不良影响[5]。女贞子具有抗炎抑菌、抗氧化、抗衰老、增强免疫力等多重药理作用[6]。研究发现，女贞子及其提取物具有较强的抗氧化活性，能够有效清除机体的自由基，减少机体受到的应激伤害[7-8]。Liu等[9]在环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型中发现女贞子多糖具有调节免疫和抗氧化的作用。α-甘露聚糖肽具有多种生物活性功能，作为一种新型的畜禽免疫增强剂可以增强动物机体的免疫力和耐受能力，从而减少抗生素使用[10]。李守现等[11]研究发现，α-甘露聚糖肽可以增强机体细胞免疫、小肠原始淋巴细胞的活性和小肠内白细胞吞噬能力。刘尚智等[12]、蒋守群[13]研究发现，将女贞子和甘露聚糖作为添加剂使用具有消炎抗病、抗氧化等多种功效。本研究探讨女贞子、α-甘露聚糖肽单独及联合运用对热应激小鼠模型的体重、血液指标及肝脏热应激蛋白表达的影响，探索其抗热应激的作用机制。1材料与方法1.1试验材料女贞子提取液制备：女贞子（郑州泰隆大药店）经洗净，晒干，粉碎，反复熬制浓缩而成。α-甘露聚糖肽（益新爱克）购自西南泰乐星生物科技有限公司。PCR引物、tips购自Generay公司，葡萄糖（GLU）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、皮质醇（CORT）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。引物由上海派森诺生物有限公司合成。1.2试验仪器SW-CJ-2D超净工作台购自苏州净化设备有限公司，QL-861旋涡振荡器购自江苏省海门市麒麟医用仪器，Neofuge 13R台式高速冷冻离心购自上海力申科学仪器有限公司，EDC-810型普通PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司。1.3试验设计选用40只体重（23±2）g的小鼠，随机分为5组，分别为空白组、热应激对照组、女贞子组、α-甘露聚糖肽组、女贞子+α-甘露聚糖肽组，每组8重复，每个重复1只。饲养温度（22.0±1.0）℃，相对湿度为50%~60%，小鼠自由采食和饮水，热应激对照组和其他试验组每天13：00在培养箱中恒温42 ℃应激2 h。空白组和热应激对照组小鼠每天均灌胃0.2 mL PBS缓冲溶液，女贞子组小鼠每天灌胃女贞子液0.2 mL（0.05 mL女贞子浓缩液），α-甘露聚糖肽组小鼠每天灌胃α-甘露聚糖肽溶液0.2 mL（0.23 g α-甘露聚糖肽），热应激+女贞子+α-甘露聚糖肽组每天灌胃女贞子液0.1 mL+α-甘露聚糖肽溶液0.1 mL。试验期10 d。试验结束后，将每组小鼠摘除眼球，注射器取血液。再将小鼠进行解剖，摘取肝脏，用样品袋装好，-80 ℃冰箱保存。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能正式试验期的第1、10 d，早上9：00对小鼠进行称重，分别记为初重和末重。1.4.2血清激素水平各组小鼠称重后采血，血液凝固后在3 000 r/min离心20 min，分离血清，按照试剂盒说明书测定小鼠血清中GLU、CK、LDH、CORT水平。1.4.3HSP基因表达量引物设计见表1，由上海派森诺生物有限公司合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T001表1引物设计引物名称引物序列（5'→3'）产物长度/bpHSP60-1FCTGTGTTGAAGGTTGGAGGAA80HSP60-1RTGTAGCATTGAGAGCATCAGTAACHSP70-2FCGAGTCCTATGCCTTCAACA96HSP70-2RCACTTGTCCAGCACCTTCTHSP90-3FCCAAACCCACTCCAACC130HSP90-3RATCCTCATCGCCTTCCARQ731_Actb_3FCCTCACTGTCCACCTTCC120RQ731_Actb_3RGGGTGTAAAACGCAGCTC向组织捣碎机中加入20 mg小鼠肝脏组织和0.3 mL RnaExTM试剂，破碎细胞5~20 s（2~3次），反复颠倒混匀，室温下裂解5 min。向EP管中加入0.2 mL氯仿，漩涡振荡，混匀，室温下静置孵育2 min。12 000 r/min、4 ℃离心10 min。离心后的混合物分离为3层，RNA存在于水相。取400 μL上清液于1.5 mL EP管中，按1∶1加入400 μL异丙醇，充分混匀，-20 ℃下放置20 min。将混合液在12 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃去上清。加入1 mL 75%乙醇，混匀，2 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃去上清。重复上述步骤1次，12 000 r/min、4 ℃离心1 min，吸取残留液体，注意不能接触沉淀。开盖晾干3 min，让残留的乙醇挥发完全，加50 μL的DEPC水溶解RNA，55~60 ℃助溶10 min。测定OD260 nm值，确定RNA质量，并进行琼脂糖凝胶电泳，确定抽提RNA的完整性和DNA的污染情况。将所得RNA进行逆转录或放在-20 ℃保存。配制第一链cDNA合成反应液，在RNase free离心管中配置逆转录反应体系，混匀。进行逆转录反应：25 ℃反应10 min，50 ℃反应30 min，85 ℃反应5 min。产物cDNA可立即用于荧光定量PCR反应。逆转录反应体系见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T002表2逆转录反应体系试剂添加量RNase free ddH2O15 μL5×HiScrip®ⅡqRT Super Mix2 μL模板RNA700 ng进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为10 μL，反应程序进行40个循环。每个处理组进行3次重复，样品的基因表达量采用2-△△ct法进行相对定量分析。向SYBR Green（10 μL）384孔板中加入试剂，反应体系见表3。反应程序见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T003表3反应体系试剂体积/μLSYBR Green Mix4.4Primer-F0.3Primer-R0.3cDNA5.010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T004表4反应程序项目温度/℃时间/s循环数预变性956001变性951040退火延伸60349515溶解曲线采集6060195306015反应进行40个循环，最后进行1个循环检测荧光信号，得到各组内参基因和HSP基因的Ct值。1.5数据统计与分析采用SPSS 23.0软件进行数据分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠生长性能的影响（见表5）由表5可知，小鼠体重均有所增加，但热应激对照组小鼠体重增长比较缓慢，末重显著低于空白组、女贞子组和α-甘露聚糖肽组（P0.05）。女贞子组与α-甘露聚糖肽组小鼠末重差异不显著（P0.05），但两者均显著高于女贞子+α-甘露聚糖肽组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T005表5女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠生长性能的影响组别初重末重空白组24.08±0.4230.88±0.32a热应激对照组23.85±0.5425.26±0.49b女贞子组22.78±0.8429.68±0.46aα-甘露聚糖肽组23.54±0.9230.16±0.76a女贞子+α-甘露聚糖肽组24.13±0.7226.06±0.81b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。g/只2.2女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠血清激素水平的影响（见表6）由表6可知，空白对照组、女贞子组和α-甘露聚糖肽组小鼠的血糖、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、皮质醇水平均极显著低于热应激对照组（P0.01）。女贞子+α-甘露聚糖肽组小鼠的血糖、乳酸脱氢酶、皮质醇水平极显著低于空白组（P0.01）。女贞子+α-甘露聚糖组小鼠的肌酸激酶活性极显著高于热应激对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.T006表6女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠血清激素水平的影响组别血糖/(mmol/L)肌酸激酶/(U/L)乳酸脱氢酶/(U/L)皮质醇/(μg/dL)空白对照组8.010±0.733A1 119.390±88.042A1 154.00±286.28A0.946±0.076A热应激对照组10.426±0.899B2 232.330±12.423B1 550.33±41.55B1.163±0.510B女贞子组8.113±0.097A1 126.000±105.731A849.33±7.37A0.903±0.064Aα-甘露聚糖肽组8.156±0.065A1 157.000±50.408A907.01±8.03A0.875±0.061A女贞子+α-甘露聚糖肽组9.960±0.312B3 537.000±34.073C1 459.33±36.67B1.144±0.051B2.3女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP表达量的影响2.3.1女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP60表达量的影响（见图1）由图1可知，热应激对照组小鼠的HSP60表达量相比空白组急剧上升；单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽小鼠的HSP60表达量相比热应激对照组下降明显；当女贞子和α-甘露聚糖肽复合使用时，HSP60表达量相比单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽上升明显，但与热应激对照组无明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.F001图1女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP60表达量的影响2.3.2女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP70表达量的影响（见图2）由图2可知，热应激对照组小鼠的HSP70表达量相比空白组上升明显；单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽HSP70表达量相比热应激对照组上升明显；当女贞子和α-甘露聚糖肽复合使用时，HSP70表达量相比空白组上升明显，而且比单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽上升更加明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.F002图2女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP70表达量的影响2.3.3女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP90表达量的影响（见图3）由图3可知，热应激对照组小鼠的HSP90表达量相比空白组上升明显；单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽HSP90表达量比热应激对照组和空白组下降明显；当女贞子和α-甘露聚糖肽复合使用时，HSP90表达量比单独使用女贞子和α-甘露聚糖肽上升明显，但与热应激对照组无明显差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.017.F003图3女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP90表达量的影响3讨论3.1女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠体重、血清激素水平的影响本研究中，各组小鼠体重均有所增加，但热应激对照组小鼠体重增长比较缓慢，表明这两种生物活性物质均可提高小鼠的生长性能。小鼠的血清激素水平可以反映机体各项生理特征的变化趋势，从而反映小鼠的热应激程度[14]。本试验中，热应激组小鼠的血糖、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、皮质醇水平相比空白组均极显著升高。当小鼠受到应激后，为了适应应激，小鼠机体通过增加能量分配来缓解不良反应。当小鼠受到热应激时，当细胞损伤时，膜通透性升高，血清酶渗入血液，活性升高，细胞膜受损，肌酸激酶渗漏至细胞外，亦可引起血清中肌酸激酶、乳酸脱氢酶活性升高[15-17]。乳酸脱氢酶是涉及无氧代谢的关键酶，小鼠在热应激条件下可以通过调整乳酸脱氢酶水平为机体供能。几乎任何应激都会使皮质醇含量升高。因此，当小鼠受到应激时，体内的血糖、肌酸激酶、乳氨酸脱氢酶、皮质醇水平均会升高。本研究中，单独使用两种药物之后，血糖、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、皮质醇水平相比热应激对照组极显著降低，表明单独使用药物以后，机体应激反应程度有所降低，两药物均有缓解热应激的功效，与劳雪芬等[18]研究一致。但两种药物复合使用后，小鼠血糖、乳酸脱氢酶、皮质醇水平与热应激对照组相比无显著差异，而肌酸激酶的含量极显著高于热应激对照组，表明两种药物复合使用后，可能无缓解热应激的功效，也可能两种药物互相拮抗。3.2女贞子、α-甘露聚糖肽对热应激小鼠HSP60、HSP70、HSP90基因表达量的影响热休克蛋白普遍存在于生物体内，按照分子量的大小分为7个家族，即HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP（small HSP，sHSP）和泛素[19]。HSP是一种应激蛋白，机体在遭受应激刺激后产生，小鼠体内的HSP基因表达量能够比较直观反映小鼠的受应激程度，应激程度越强烈HSP的表达量越多[20-21]。活性氧代谢物的大量累积是机体合成HSP的诱因。HSP70可增强机体的热耐受力[22]，是目前研究中最为广泛的一种热休克蛋白。HSP60作为热休克蛋白家族中重要成员之一，其表达的减少会促进细胞凋亡，对心肌缺血损伤具有保护作用。HSP90是抵抗热应激的主要防御蛋白[23]。本试验结果表明，热应激后小鼠体内HSP70表达量提升以增强机体对热的耐受力，同时表明热应激模型建立成功。但HSP70对细胞的保护作用有一定限度，当应激时间过长，细胞凋亡后溢出的HSP70会破坏其他细胞膜的完整性，进而加重损伤。女贞子、α-甘露聚糖肽是一种还原剂，可以通过抗氧自由基的反应降低HSP70的产生。试验结果显示，当小鼠受到热应激以后，小鼠的HSP60、HSP70、HSP90基因表达量分别空白组的1.91、2.03、1.26倍，表达量明显提高。当单独添加女贞子、α-甘露聚糖肽时，HSP60、HSP90的表达量下降明显，表明女贞子、α-甘露聚糖肽对处于热应激状态下的小鼠模型具有保护作用。研究发现，女贞子可降低和推迟热应激引起的HSP70的产生[24]，与本试验结果一致。本研究中，两种药物单独使用时有降低热应激程度的作用，而HSP70的表达量仍继续上升，可能是因为该基因在不同动物和不同组织中发挥着不同的生理学作用。曹铮[25]研究发现，女贞子可以促进奶牛HSP70的分泌，表明不同动物不同部位的HSP基因表达量可能存在差异。另外，曹煜成等[26]研究发现，HSP70基因表达量的增加提高了机体的免疫机能。王淑秋等[27]研究发现，HSP70基因表达量增加可以对神经系统起到保护作用，增加机体对外界应激的抵抗力。本研究中，当两药物复合使用时，小鼠的HSP基因表达量与热应激对照组差异不大，甚至稍高于热应激对照组，表明两种药物同时使用时可能无缓解热应激的作用，也可能两种药物混合使用时具有拮抗作用，会降低药物的抗应激作用。4结论女贞子和α-甘露聚糖肽在单独使用时均能够明显降低小鼠的热应激反应程度，但两药物混合使用时无缓解热应激作用，具体最佳搭配方案还有待进一步研究。