纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，结构复杂，不易降解，导致其利用率极低，因此筛选出高产纤维素酶的降解菌对提升畜牧产业的发展具有现实意义[1]。研究表明，纤维素降解细菌可从土壤[2]、堆肥[3-4]、反刍动物[5]和一些其他食草动物的胃肠道中[6]分离筛选，其中动物肠道中大多数菌为厌氧或兼性厌氧菌[7]。但关于马肠道中产纤维素酶的厌氧细菌的研究相对局限。马作为单胃食草动物，粗纤维在盲肠和结肠部位消化时间较长。盲肠作为主要发酵纤维的器官，含有大量的微生物。利用肠道微生物消化植物材料可将结构复杂的纤维在厌氧条件下发酵为挥发性短链脂肪酸（VFAs），用于维持机体所需的能量[8]，并且能够抑制病原体的生长，降低有害微生物活性，提高肠道免疫反应，增强肠道屏障，从而改善动物肠道健康[9]。研究表明，不同的地理、气候条件、采样时间均会导致筛选得到的纤维素降解菌有所差异[10]。本研究的菌种采自新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州昭苏县的伊犁马，旨在通过从马盲肠中分离、纯化、筛选出能够降解纤维素的厌氧细菌，为增强动物抵抗力、提升动物肠道对纤维素的利用率。1材料与方法1.1样品采集样品采自夏季新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州昭苏县舍饲状态下的成年健康伊犁马，经屠宰后采集其盲肠内容物。马盲肠内容物置于50 mL无菌离心管中，混合分成两管，一管在液氮速冻后放在-80 ℃冰箱中保存；另一管用于厌氧条件下分离高效降解纤维素的菌株。1.2培养基及试剂LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 L，pH值7.0。分离筛选纤维素降解菌的培养基（CMC筛选培养基）：CMC-Na 10 g、磷酸氢二钾1.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、氯化钠5 g、胰蛋白胨5 g、酵母粉0.5 g、琼脂25 g、还原性L-半胱氨酸0.5 g、刃天青2 mL、蒸馏水1 L，pH值7.0。发酵培养基：用于测定酶活，胰蛋白胨10 g、酵母粉 5 g、氯化钠5 g、CMC-Na 10 g、蒸馏水1 L，pH值7.0。1 g/L刚果红染色液：称取0.1 g刚果红溶于100 mL蒸馏水中。1 mol/L氯化钠溶液：称取5.85 g氯化钠溶于100 mL蒸馏水中。柠檬酸盐缓冲液：1 g CMC-Na溶于0.05 mol/L柠檬酸钠54 mL和0.05 mol/L柠檬酸46 mL后pH值调至4.8。10 g/L葡萄糖标准溶液：将1 g葡萄糖烘干至恒重，用含1% CMC-Na的0.05 mol/L柠檬酸盐缓冲液溶解并定容至100 mL，4 ℃保存。DNS试剂购自北京索莱宝公司。1.3测定指标及方法1.3.1纤维素降解细菌的分离将一管用于分离的马盲肠内容物放入厌氧手套箱中，使用4层纱布挤压过滤。处理后的新鲜盲肠内容物在厌氧手套箱中吸出1 mL进行10-1~10-9倍连续梯度稀释，分别取100 μL的菌液，使用一次性涂布棒均匀涂布在CMC筛选培养基上，37 ℃厌氧培养3~5 d。观察菌落的生长情况，选择菌落密度合适的培养皿，使用高压灭菌的牙签挑取不同形态的单菌落置于发酵培养基，37 ℃倒置厌氧培养2 d，在CMC固体培养基上进行三次划线纯化。取分离的菌液1 μL分别点种于CMC固体培养基上，37 ℃倒置厌氧培养3 d，用1 g/L刚果红染色液染色1 h，弃废液，再用1 mol/L氯化钠溶液脱色1 h。观察菌落边缘是否有透明水解圈，测量并计算水解圈直径（H）与菌落直径（C）的比值（H/C），根据比值初步确定菌株纤维素酶活能力。1.3.2分离菌株纤维素酶活选取几株H/C较大的菌株测定酶活，统一将选取菌株的OD600 nm值调至0.1，接种于液体发酵培养基，37 ℃、120 r/min振荡培养48 h，测定酶活。将菌液从厌氧箱中吸出，6 000 r/min离心5 min，收集上清液。干净的玻璃试管中分别加入500 μL底物溶液（含1% CMC-Na的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，pH值4.8），空白对照组的试管中加500 μL培养基，试验组试管中加500 μL菌液上清，将其置于50 ℃水浴30 min。反应结束后，加入DNS溶液3 mL，将反应混合物沸水浴5 min，降至室温后测量OD540 nm值，每管3个重复，取平均值，所得结果代入标准曲线和酶活力公式中进行计算。葡萄糖标准曲线的绘制：配制0.1~1.0 g/L的葡萄糖溶液，空白对照为0 g/L的葡萄糖标准溶液，参考上述酶活力测定的方法测量OD540 nm值。以OD值为Y轴，葡萄糖含量为X轴，绘制标准曲线。酶活力=[（样本吸光度-对照吸光度）+标曲截距/(标曲斜率×底物溶液的体积×反应时间)]×1 000(1)1.3.3分子生物学鉴定使用细菌通用引物27F（5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1 492R（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）对筛选后的菌株进行PCR扩增。PCR反应体系（总体积20 μL）：PrimeSTAR Max Premix 10 μL、上下游引物各0.6 μL、菌液0.5 μL、ddH2O 8.9 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃延伸3 min。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的条带大小在1 500 bp左右则电泳检测合格，切胶回收，送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行16S rDNA测序。测序后的序列通过NCBI进行BLAST比对，选择相似度最高的序列作为鉴定结果，确定各菌株的种属，再利用MEGA 11软件构建进化树。2结果与分析2.1马盲肠中纤维素降解菌的分离筛选结果（见图1、表1）收集的马盲肠内容物利用CMC-Na为纤维素源在厌氧环境下分离纯化共获得25株菌株，利用刚果红染色法筛选得到12株能够降解纤维素的菌株。纤维素酶菌株产生水解圈见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.F001图1纤维素酶菌株产生的水解圈由表1可知，F2-A4菌株的H/C为5，明显高于其他菌株，表明F2-A4菌株在CMC筛选培养基上生长的最好，初步鉴定F2-A4菌株降解纤维素的能力最强；F1-G4和103未出现水解圈。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.T001表1纤维素降解菌的水解圈与菌落的直径比值项目H/cmC/cmH/C项目H/cmC/cmH/CF1-A40.650.203.25F2-A42.000.405.00F1-A71.000.601.66F2-A110.400.202.00F1-D11.200.781.54F2-B110.580.282.07F1-D20.300.201.50F2-B120.500.451.11F1-F31.401.201.17F2-C30.600.302.00F1-F70.320.201.60F1-H70.500.401.252.2菌株的复筛结果2.2.1葡萄糖标准曲线测定结果不同葡萄糖含量相应OD540 nm值见表2，根据OD540nm值与葡萄糖含量可制作葡萄糖标准曲线为y=2.169 2x-0.192 9，R2=0.999 1，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.T002表2不同葡萄糖含量对应的OD540 nm值项目葡萄糖浓度/(g/L)00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0OD540 nm值00.0060.2140.4830.6920.9041.0991.3431.5581.7531.95010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.F002图2葡萄糖标准曲线2.2.2CMC酶活力测定结果（见表3）将12株厌氧纤维素降解菌在液体发酵培养基活化后调整至同一OD值，厌氧培养发酵48 h后测定酶活力。由表3可知，12株菌株酶活力排序为：F2-A4F2-B11F1-A7F2-B12F1-A4F1-D1F2-A11F1-F3F1-H7F2-C3F1-D2F1-F7，其中F2-A4酶活力最高为14.841 U/mL，F1-F7酶活力最低为8.295 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.T003表3CMC酶活力测定结果项目酶活力项目酶活力F1-A49.278F1-F38.725F1-A79.371F2-A118.787F1-D19.063F2-A414.841F1-D28.387F2-B1110.477F1-F78.295F2-B129.340F1-H78.510F2-C38.449U/mL2.3厌氧纤维素降解菌分子学鉴定结果（见图3、图4）由图3可知，12株厌氧纤维素降解菌的PCR扩增获得的目的片段与预期比较相符合，片段大小为1 500 bp左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.F003图3菌株的16S rDNA基因电泳检测结果注：M为DNA Marker2000+；1~12分别为F2-A4、F2-B11、F1-A7、F2-B12、F1-A4、F1-D1、F1-G4、F2-A11、F1-F3、F1-H7、F2-C3、F1-D2、F1-F7。结合16S rDNA基因序列分析法及系统发育进化树，结果见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.015.F004图4厌氧纤维素降解菌的进化树由图4可知，从马盲肠内容物中分离出这12株厌氧纤维素分解菌分别属于肠球菌属、乳杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根氏菌属，其中F2-B11、F1-F3、F1-A4、F1-H7离海氏肠球菌遗传距离较近，F1-D1、F1-F7处在粪肠球菌的分支上，F1-D2、F2-A4和敏捷乳杆菌相似度最高，F2-B11、F2-C3离普罗威登斯菌遗传距离最近，F1-A7、F2-A11处在摩根氏菌的分支上。3讨论纤维素生物质是丰富的可再生生物资源。提高纤维素酶的产量和催化效率是降解纤维素的关键，但目前纤维素酶产生的调控机制仍不清楚[11]。鉴定和优化高纤维素酶活的菌株可解决因纤维素结构原因导致的纤维素利用率的问题[2]。马对粗纤维饲料具有较强的消化能力，在盲肠中饲料中的营养成分能够更好地发酵和利用，同时分离物具有较高活性[12]。饲喂高纤维饲料的草食动物胃肠道可作为降解纤维素的微生物来源。因此，本试验从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧菌，为饲料微生物添加剂开发及应用提供候选菌种资源。敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis）是一种兼性异源发酵的细菌，可通过糖酵解途径或磷酸戊糖途径产生乙酸、甲酸等，或在氧不足情况下葡萄糖生成乳酸[13]。敏捷乳杆菌在猪粪、鸡肠道、鸽子肠道、药用植物根系等均可分离得到，具有抗菌、抗炎等能力，能够作为潜在的益生菌[14-19]。Nurliana等[20]基于16S rRNA基因鉴定从蛋鸡肠道中分离出4株肠球菌能够降解纤维素，发现其中两株为海氏肠球菌（Enterococcus hirae），能够提升蛋鸡的生产效率，改善家禽健康。乳酸菌能够产生乳酸和细菌素，还可产生几种细胞外酶，如淀粉酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶和纤维素酶[21]，这可能是上述菌株具有纤维素降解能力的原因之一。Focková等[22]研究表明，马的粪便中存在一些能够产细菌素的肠球菌，具有益生菌特性，可应用于家畜的营养补充剂。目前已有研究通过宏基因组测序技术发现，马肠道细菌群落主要集中在厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门和放线菌门[23]。饮食、生存环境和年龄等因素均会影响马肠道微生物群落的变化，而饲喂高纤维饲料可提高微生物稳定性[24]。本试验中，所筛选出的纤维素降解菌株属于厚壁菌门和变形菌门，具有作为动物的饲料添加剂和肠道菌群稳定剂的潜力。特定的微生物作用于不同的物种可能效果不同，其机制还需进一步探究[25]。在无菌小鼠的模型中利用成像技术证明，粪肠球菌适应性极强，极易在肠上皮定植并形成生物膜[26]。从蜜蜂肠道中分离出的摩根氏菌（Morganella morganii）对幼虫类芽孢杆菌表现出显著的抗菌活性，可在蜜蜂疾病（AFB）的预防或治疗中发挥重要作用[27]。Nara等[28]发现，从腐烂的马铃薯中能够分离出雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri），其在发酵过程中产生的叶酸可作为氧化还原介质，形成小型环保的微生物燃料，为生物质降解的未来研究提供了参考。本研究所筛选的厌氧纤维素降解菌中F2-A4具有最高的纤维素酶活力，与敏捷乳杆菌同源性高，可作为动物饲料的益生菌候选菌种，在制作成食品级工程乳酸菌方面具有潜力。后续将针对F2-A4菌种的饲料营养及适口性方面开展深入研究，以期发挥厌氧菌株高效降解纤维素的能力，从而提升动物肠道纤维素的利用率，增强动物机体抵抗力。4结论本试验从马盲肠内容物中分离培养纤维素降解的厌氧菌，经过初筛、复筛后共筛选出12株厌氧纤维素降解菌，经鉴定分别属于乳杆菌属、肠球菌属、普罗威登斯菌属、摩根氏菌属，其中F2-A4作为敏捷乳杆菌具有较高的纤维素酶活力。