努比亚山羊原产于非洲东北部的努比亚地区，具有产肉量高、性情温顺、耐热性好等优势，近年来在广西地区的养殖规模不断扩大[1]。象草是多年生高产暖季型牧草，具有产量高、品质好、适应性广、抗逆性强、饲喂效果好的特点，已成为南方重要的饲草资源。象草水溶性碳水化合物含量低，粗纤维（CF）含量高，直接饲喂效果较差，经微生物发酵处理可提高其营养价值和饲料适口性。李莉等[2]发现，添加纤维素酶和混合添加纤维素酶与淀粉均能够提高象草青贮的营养成分含量、发酵品质和乳酸菌数量。谢华德等[3]发现，添加乳酸菌可改善象草发酵品质，提高象草青贮饲料的营养价值。高晓梅等[4]发现，在象草中添加不同浓度的添加剂和农副产物进行混合青贮，可降低青贮饲料的pH值和纤维含量，提高干物质（DM）和粗蛋白质（CP）含量，改善象草青贮感官品质。李孟伟等[5]研究表明，象草直接青贮品质不高，添加尿素、玉米粉、豆粕和麦麸等进行青贮均能够明显提高发酵品质。Mugabe等[6]研究发现，植物乳杆菌可使象草发酵产生大量的乳酸，降低发酵象草的pH值、乙醇和氨态氮含量。瘤胃是反刍动物特有的消化器官，含有大量细菌、真菌、古菌和原虫，不同的遗传背景、日粮和饲养环境均可对反刍动物的瘤胃菌群结构造成影响[7]。发酵象草中的微生物会对反刍动物瘤胃微生物群落结构产生影响，改变肠道的微生态平衡。彭丽娟等[8]研究发现，10%象草组和20%象草组可改变水牛瘤胃细菌的相对丰度，提高了瘤胃内丁酸和总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度。研究表明，发酵桂闽引象草能够提高鸡的肠道菌群丰度，改善鸡的屠宰性能和鸡肉品质[9]。黄志朝等[10]发现，基础日粮中添加20%发酵紫色象草能够促进育肥猪生长，改善胴体品质以及肉品质，节约精料成本。目前，关于发酵象草对羊生长性能及其肠道微生物多样性影响的研究鲜有报道。本试验旨在探讨山羊日粮中添加经微生物发酵处理的象草对山羊生长性能和肠道微生物群落结构的影响，为提高饲料利用效率提供参考。1材料与方法1.1试验材料努比亚山羊由广西田阳良农农牧有限公司提供。微星一号生物菌剂为中国科学院微生物研究所研发，主要成分是植物乳杆菌（≥2.0×107 CFU/g）、粪肠球菌（≥2.0×107 CFU/g）、枯草芽孢杆菌≥1.0×106 CFU/g）、酿酒酵母（≥1.0×106 CFU/g）。青贮发酵剂由南宁微瑞生物科技有限公司生产，主要成分为枯草芽孢杆菌≥5.6×107 CFU/g、沼泽红假单胞菌≥2.0×107 CFU/g、乳酸菌≥4×106 CFU/g等，综合菌种≥1010 CFU/g。1.2试验设计及饲养管理试验选取64只健康、体重相近、3~4月龄的努比亚山羊随机分成4组，每组16个重复，每个重复1只羊。S-1组、S-2组、S-3组山羊饲喂精料+不同处理青贮象草，C-4组（对照组）山羊饲喂精料+新鲜象草，每只羊每日补充300 g精补料（郑州六品农牧有限公司）。试验采取全舍饲方式，早晚各饲喂1次，山羊自由采食、饮水。试验期共70 d，其中预试期10 d，正式试验期60 d。精补料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.T001表1精料营养水平项目水分粗脂肪粗蛋白中性洗涤纤维酸性洗涤纤维钙总磷含量11.542.1714.9544.9019.140.720.61%1.3发酵象草的制作新鲜象草晾晒4 d后，使用铡草机切割为1~2 cm的小段，机器中边切割边喷洒微生物菌剂边搅拌，经过压缩机在出口处进行压缩打包。S-1组象草添加1.0%微星一号生物菌剂和15%米糠（米糠在切割象草时添加）发酵，S-2组象草添加1.0%微星一号生物菌剂发酵，S-3组添加1.0%青贮发酵剂发酵。打包后在仓库堆放发酵30 d。各组发酵象草营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.T002表2发酵象草营养水平组别水分/%粗脂肪/%粗蛋白/%中性洗涤纤维/%酸性洗涤纤维/%可溶性糖/%pH值S-1组76.302.078.5067.854.70.623.8S-2组79.261.926.9170.661.40.603.6S-3组76.051.108.7168.255.40.633.7C-4组（对照组）71.600.597.1372.752.30.937.01.4测定指标及方法1.4.1生长性能试验第1 d和最后1 d，各组山羊空腹12 h后进行称重。记录试验期间各组山羊的采食量，计算平均日采食量、平均日增重、料重比。平均日增重=(末重－初重)/试验天数(1)平均日采食量=总采食量/(试验天数×山羊数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.4.2肠道微生物测序试验结束后，每组随机选择3只羊，采集其粪便样本。将收集的粪便样品送广州基迪奥生物科技有限公司提取DNA，选择16S rRNA基因的样本中提取基因组DNA后，使用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3+V4区。引物序列为341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT，将纯化后的扩增产物（即扩增子）连接测序接头，构建测序文库，Illumina上机测序，比较分析各试验组之间肠道微生物群落的差异。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。利用OmicShare在线平台对不同组间的微生物相对丰度进行分析，并进行Alpha多样性分析，包括多样性指数（Shannon指数、Simpson指数）、丰富度指数（Ace指数、Chao指数），分析不同组间物种组成及各分类水平物种差异分析。2结果与分析2.1发酵象草对努比亚山羊生长性能的影响（见表3）由表3可知，采用发酵象草饲喂的S-1组、S-2组、S-3组山羊平均日采食量比C-4组提高了16.04%、18.18%、18.18%（P0.05）。S-1组山羊的平均日增重显著高于C-4组（P0.05）。S-1组山羊的料重比最低，C-4组其次，S-3组料重比最高，显著高于S-1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.T003表3发酵象草对努比亚山羊生长性能的影响组别初重/(kg/只)末重/(kg/只)平均日采食量/[kg/(只·d)]平均日增重/[kg/(只·d)]料重比S-1组17.21±1.3622.15±1.43a2.17±0.17ab0.16±0.05a13.56±1.52bS-2组16.59±1.6621.02±1.75b2.21±0.16a0.14±0.03ab15.78±1.04abS-3组17.34±1.1521.24±1.83b2.21±0.16a0.13±0.04ab17.02±1.13aC-4组18.16±1.4421.94±1.71b1.87±0.28c0.12±0.03b15.58±1.76ab注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2发酵象草对努比亚山羊肠道OTU及丰度的影响对4组样本的OTU统计分析见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.T004表4样品测序数据统计组别Total TagsUnique TagsOTUsS-1组83 99150 9281 057S-2组85 81754 2441 065S-3组88 09954 9231 021C-4组85 05850 3701 058由表4可知，S-1组获得了1 057个OTUs，S-2组获得了1 065个OTUs，S-3组获得了1 021个OTU，C-4组获得了1 058个OTUs。不同组样品中OTUs分布韦恩图见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F001图1不同组样品中OTUs分布韦恩图由图1可知，4组样本共享了764个OTU，3个试验组共享了828个OTU。不同组样品的稀释曲线见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F002图2不同组样品的稀释曲线由图2可知，当测序的总Tag数到达40 000以后，各组样品稀释曲线均基本趋于平缓，各组样品的OTU数量达到1 000左右，物种并不会随测序数量的增加而显著增多，表明本试验的数据量可靠。2.3发酵象草对努比亚山羊肠道菌群的结构的影响2.3.1发酵象草对努比亚山羊肠道细菌门水平分布的影响（见图3）由图3可知，对所有试验组和对照组进行肠道菌群的结构与组成分析，共获得25个门、234个属。试验组与对照组之间肠道菌群的结构与组成差异较大，试验组有5个优势菌群门（含量1%），S-1组、S-2组、S-3组山羊肠道厚壁菌门（Firmicutes）的占比为54.15%、60.90%、48.06%，拟杆菌门（Bacteroidetes）的占比为2.78%、3.19%、3.12%，疣微杆菌门（Verrucomicrobia）的占比为15.95%、10.32%、18.39%、浮霉菌门（Planctomycetes）的占比为22.34%、21.94%、26.78%、变形菌门（Proteobacteria）的占比为1.39%、1.88%、1.03%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F003图3发酵象草对努比亚山羊肠道细菌门水平分布的影响C-4组有4个优势菌群门，其中厚壁菌门占比为67.37%，拟杆菌门占比为3.61%，浮霉菌门占比为1.68%，疣微杆菌门占比为24.92%。2.3.2发酵象草对努比亚山羊肠道细菌属水平分布的影响（见图4）由图4可知，S-1组有11个优势菌属，S-2组有12个优势菌属，S-3组有13个优势菌属，C-4组有14个优势菌属。S-1组、S-2组、S-3、C-4组瘤胃球菌科UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）占比分别为9.31%、12.93%、9.39%、16.28%，理研菌科RC9肠道群（Rikenellaceae_RC9_gut_group）5.02%、3.74%、6.45%、11.64%，克里斯滕森菌科R-7群（Christensenellaceae_R-7_group）5.98%、7.93%、6.34%、8.91%，琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）0.73%、0.29%、1.05%、2.69%，产粪甾醇优杆菌属群（Eubacterium_coprostanoligenes_group）3.02%、5.05%、4.14%、4.67%，嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia）22.30%、21.93%、26.77%、1.68%，瘤胃球菌科UCG-013（Ruminococcaceae_UCG-013）2.31%、3.87%、3.73%、3.51%，瘤胃球菌科UCG-010（Ruminococcaceae_UCG-010）2.18%、3.03%、1.99%、3.41%，拟杆菌属（Bacteroides）3.67%、2.31%、3.63%、3.29%，另枝菌属（Alistipes）0.96%、0.89%、1.60%、2.58%，瘤胃球菌科UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）1.34%、1.83%、1.06%、1.88%，罗氏菌属（Roseburia）2.31%、0.31%、0.48%、1.03%，瘤胃球菌科NK4A214（Ruminococcaceae_NK4A214_group）1.03%、1.03%、0.79%、1.34%，瘤胃球菌科UCG-014（Ruminococcaceae_UCG-014）0.84%、1.10%、1.14%、1.09%，未知菌属（p-1088-a5_gut_group）0.94%、1.32%、0.81%、0.58%，普雷沃氏菌科UCG-004（Prevotellaceae_UCG-004）0.77%、0.78%、1.91%、0.38%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F004图4发酵象草对努比亚山羊肠道细菌属水平分布的影响2.4发酵象草对努比亚山羊肠道菌群多样性的影响（见图5、图6）由图5可知，S-1组、S-2组的Ace指数和Chao指数均高于C-4组，Simpson指数低于C-4组，S-3组的Shannon指数和Simpson指数低于C-4组，试验组与对照组的ACE指数、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数之间存在明显差异，表明饲喂发酵象草可改变努比亚山羊肠道菌群丰富度和多样性。图5山羊的肠道微生物α多样性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F5a1（a）Shannon指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F5a2（b）Simpson指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F5a3（c）Chao指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F5a4（d）ACE指数由图6可知，不同分组的样品相互之间并没有完全重叠，说明饲喂发酵的象草可改变羊肠道菌群结构，各试验组和对照组的组内相似性比组间相似性高，各组间菌群多样性存在差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F006图6β多样性的主坐标分析（PCoA）2.5发酵象草对努比亚山羊细菌菌群丰度的影响（见图7）对不同组间的细菌群落丰度进行组间差异分析，对不同组间的物种丰度的均值进行t检验，对在一个样本的相对丰度达到1%以上的物种的优势菌群进行检测。由图7可知，其中各组嗜黏蛋白阿克曼菌、瘤胃球菌科UCG-005、理研菌科RC9肠道群、瘤胃球菌科NK4A214均存在显著差异，而瘤胃球菌科UCG-014、未知菌属、琥珀酸弧菌属差异不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.002.F007图7发酵象草对努比亚山羊细菌菌群丰度的影响3讨论3.1不同发酵象草对努比亚山羊生长性能的影响在本研究中，各组山羊精料采食量相同，但是发酵象草和新鲜象草的采食量不同，各试验组发酵象草的采食量高于对照组，表明发酵提高象草的适口性，可明显增强羊的食欲，提高采食量。本试验中，试验组山羊的平均日增重高于对照组，S-1组山羊的料重比低于C-4组，但S-2组和S-3组料重比高于C-4组，表明象草可直接青贮但品质不高，添加米糠等物料进行青贮能够明显提高青贮发酵品质。何秀等[11]研究发现，发酵后的象草能够提高蛋白质含量，降低pH值和氨态氮比值。李莉等[2]研究发现，添加纤维素酶和混合添加纤维素酶与淀粉均能够提高象草青贮的营养成分含量、发酵品质。黄志朝等[10]研究发现，在猪日粮中添加20%的发酵紫色象和桂闽引象草均能够促进育肥猪的生长，降低饲养成本。周晓情等[9]研究发现，发酵象草能够提高鸡的生长性能及肉品质。3.2不同发酵象草对努比亚山羊肠道微生物的影响本试验利用Illumina MiSeq测序技术对饲喂青贮象草后的努比亚山羊的肠道微生物菌群进行检测，结果发现，山羊肠道中的厚壁菌门、拟杆菌门、疣微杆菌门、浮霉菌门、变形菌门是优势菌群。不同动物、地方和日粮组成均会影响羊肠道微生物的优势菌门[12]。王继文等[13]研究发现，波尔山羊瘤胃和粪便中微生物组成存在着较大差异，瘤胃中优势菌门为拟杆菌门，厚壁菌门次之；粪便中则相反，优势菌门为厚壁菌门，拟杆菌门次之。Jesús-Laboy等[14]研究发现，圈养山羊和野山羊粪便中厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门相对丰度较高。王循刚等[15]研究发现，厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门是藏系绵羊粪便中丰度高的优势菌门。草食性动物的肠道内，厚壁菌门是分解纤维素的主要菌群[16]。本试验中，试验组山羊肠道厚壁菌门的相对丰度均显著低于对照组。原因是象草经微生物发酵后粗纤维类物质转变成动物易消化吸收的小分子物质，需要分解的纤维素含量降低，导致肠道内厚壁菌门的相对丰度下降[17-18]。魏子维等[19]研究发现，在雷州山羊日粮中提高精料的添加比例可显著降低粪便中拟杆菌门和疣微菌门相对丰度，本试验中，试验组山羊肠道拟杆菌门丰度低的原因可能是象草经过发酵后，营养成分有所提升，试验日粮中所含草料比例较高造成。研究表明，浮霉菌门多存在于厌氧环境下，并且包含多种厌氧氨氧化细菌[20]。象草经长时间发酵后，厌氧菌含量显著升高。本试验中，试验组山羊肠道浮霉菌门的丰度显著高于对照组。Min等[21]研究发现，山羊粪便中相对丰度最高的为变形菌门。但本试验中，仅试验组肠道中变形菌门为优势菌门，可能与本试验的饲养方式有关。Hao等[22]研究表明，益生菌能通过耗氧建立关键微生物群，如普雷沃氏菌、梭状芽孢杆菌，降低厚壁菌门中瘤胃球菌属的丰度。本试验中，对照组山羊肠道中的瘤胃球菌科UCG-005、瘤胃球菌科NK4A214、普雷沃氏菌科UCG-004丰度高于试验组；在疣微菌门中，试验组嗜黏蛋白阿克曼菌显著高于对照组。嗜黏蛋白阿克曼菌能降解肠道内壁产生的多余黏蛋白，可抗炎，减少结肠癌的发生概率[23]。本试验通过对肠道菌群进行α多样性分析，发现试验组和对照组中的OTU数目差异不显著，Ace指数、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数之间具有显著性差异，表明饲喂发酵象草可以改变努比亚山羊肠道菌群丰富度和多样性。原因是发酵象草在发酵过程中存在的大量乳酸菌，促进了肠道内形成新的微生态平衡。本试验中β多样性分析的结果表明，饲喂发酵象草后，试验组和对照组菌属组成差异较大，不同的试验组间也会存在一定距离，对肠道菌群的菌属结构产生一定影响。4结论本试验结果表明，利用1.0%微星一号生物菌剂和15%米糠进行发酵可提高象草的适口性和营养价值，改变努比亚山羊肠道菌群丰富度和多样性，山羊肠道中的优势菌群为厚壁菌门、拟杆菌门、疣微杆菌门、浮霉菌门、变形菌门。