菜籽饼粕类原料作为榨油后的副产物，具有蛋白质含量高、氨基酸组成较合理等优点，是重要的蛋白质饲料替代原料之一[1-2]。但我国油菜籽品种繁多、产地分布广泛，且菜籽饼粕的加工工艺较繁杂，使菜籽饼粕的营养价值差异较大[3]。因此，研究菜籽饼粕的常规化学组成成分可以充分发挥其营养价值。饲用酶制剂是一种具有催化活性的蛋白类物质，可调节动物肠道微生态平衡，提高饲料养分消化率，提高动物生长性能，改善动物健康[4-5]。其中，蛋白酶作为可以催化蛋白质肽链水解的一类酶，可将难消化的大分子蛋白质水解成利于消化吸收的小分子肽和氨基酸，从而提高饲料蛋白利用率，成为饲料行业应用最广泛的酶制剂之一。淀粉是植物细胞储存能量的主要方式，也是动物体重要的能量来源之一[6]。淀粉酶是催化淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖及糊精一类酶的总称。畜禽日粮中添加淀粉酶能够提高饲料的消化吸收和改善生产性能[7]。Agboola等[8]、胡玲玲[9]、Yi等[10]研究发现，动物饲粮中添加淀粉酶可提高动物生长性能，提高饲料转化率。原因可能是添加外源淀粉酶破坏了植物细胞壁结构，导致细胞壁内的蛋白质、矿物质等营养物质被释放，从而对畜禽生产性能起到很好的促进作用。本试验在检测两个菜籽饼常规营养成分并感官判断其生熟度的基础上，进一步检测了菜籽饼加工过程参数，利用SDS-Ⅲ检测外源酶对不同加热程度菜籽饼体外养分消化率的差异，为更好地了解菜籽饼常规营养成分和额外补加外源酶对菜籽饼养分消化率的影响提供参考。1材料与方法1.1试验材料单胃动物仿生消化系统（SDS-Ⅲ）由湖南中本智能科技发展有限公司提供，仿生酶购自湖南中本智能科技发展有限公司。外源酶蛋白酶Proact（酶活：75 000 prot/g）、淀粉酶A酶（酶活：1 000 KNU/g）购自帝斯曼维生素上海有限公司。试验评估原料菜籽饼购自云南某养殖公司。1.2试验设计采用2×2双因素完全随机设计，设4个组，分别以不添加外源酶的正菜籽饼和过热菜籽饼（高温螺旋压榨法加工＞130 ℃，25 min，加工过程温度或时间未控制好造成过热加工）为对照组，试验组分别向正菜籽饼和过热菜籽饼中添加外源酶蛋白酶Proact 15 prot/g、淀粉酶A酶0.4 KNU/g，每组5个重复，每个重复1根消化管。采用四分法采集样品，使用万能粉碎机粉碎过60目筛，充分混匀，于-20℃冰箱保存。1.3试验方法本试验使用SDS-Ⅲ模拟试样在肉鸡胃肠道的消化过程。操作步骤为：称取（1.000 0±0.000 2）g试样于装有透析袋的消化管中，加入20 mL配制好的胃消化液（将一份胃消化酶完全溶于250 mL pH值2.0盐酸溶液中，盐酸溶液于41 ℃温度环境下调节pH值为2.0）。将仿生消化管固定在已预热好的SDS-Ⅲ上，连接好缓冲液管路和加酶管路。胃阶段模拟消化（温度41 ℃条件下消化4 h）结束后，将2 mL小肠消化液移入SDS-Ⅲ的小肠消化液储备室中，继续进行7.5 h的小肠前段消化和7.5 h小肠后段消化。体外消化结束后，收集仿生消化残渣，计算干物质消化率（IVDMD）、体外表观粗蛋白质消化率（IVACPD）、体外标准化粗蛋白质消化率（IVSCPD）、体外脱脂干物质消化率（IVDDMD）、酶水解物能值（EHGE）、体外能量消化率（IVGED）。IVDMD=(m1-m2)/m1×100%(1)IVACPD=(CP1-CP2)/CP1×100%(2)IVSCPD=(CP1-CP2+CP0)/CP1×100%(3)IVDDMD=(m1-m3)/m1×100%(4)EHGE=(GE1-GE3)/m1×100%(5)IVGED=(GE1-GE3)/GE1×100%(6)式中：m1为上样饲料干物质的质量（g）；m2为未消化残渣干物质的质量（g）；m3为脱脂后未消化残渣干物质的质量（g）；CP1为上样饲料粗蛋白质的质量（g）；CP2为未消化残渣粗蛋白质的质量（g）；CP0为粗蛋白质内源损失量（g）；GE1为上样饲料总能（MJ/kg）；GE3为脱脂后未消化残渣总能（MJ/kg）。1.4测定指标及方法2种菜籽饼原料和仿生消化残渣中干物质（DM）参考GB/T 6435—2014测定；粗蛋白质（CP）参考GB/T 24318—2009测定；粗脂肪（EE）参考GB/T 6433—2006测定；粗纤维（CF）参考GB/T 6434—2022测定；粗灰分（Ash）参考GB/T 6438—2007测定；总能（GE）使用ICA 3000全自动绝热式氧弹计测定。2种菜籽饼原料酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）使用近红外分析仪NIRS DS2500测定；2种菜籽饼原料加工综合指数（PCI）、蛋白分散指数、KOH蛋白溶解度、活性赖氨酸及活性赖氨酸/总氨基酸比值测定使用AMINORED 2.0测定。1.5数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel软件进行整理和计算，使用SPSS 28统计软件的一般线性模型（GLM）程序对试验数据进行双因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，建立加热程度主效应、外源酶主效应及两者的互作效应。若出现互作效应，采用单因素方差分析对试验数据进行进一步分析。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.12种不同加热程度菜籽饼的常规营养水平和总能（见表1）由表1可知，与正常菜籽饼相比，过热菜籽饼的CP、CF、ADF、NDF含量高，EE、GE含量低，可能与两个菜籽饼的品种、来源及加工工艺有关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.021.T001表12种不同加热程度菜籽饼的常规营养水平和总能组别DM/%CP/%EE/%CF/%Ash/%ADF/%NDF/%GE/(MJ/kg)正常菜籽饼92.4635.2413.9911.436.0120.631.720.39过热菜籽饼93.9438.117.3116.146.4928.952.219.792.22种不同加热程度菜籽饼加工过程表征参数（见表2）加工综合指数（PCI）在10~20为正常，0~10为过度加工，大于20~30为加工不足。由表2可知，过热菜籽饼PCI为4，属于过度加工，且过热菜籽饼的活性赖氨酸及活性赖氨酸/总赖氨酸的值下降较多，表明过热加工对其活性赖氨酸有破坏作用，可降低赖氨酸消化率，侧面说明过热加工可能会对其粗蛋白质消化率有负面影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.021.T002表22种不同加热程度菜籽饼加工过程表征参数组别加工综合指数（PCI）蛋白分散指数/%KOH蛋白溶解度/%活性赖氨酸/%活性赖氨酸/总赖氨酸/%正常菜籽饼118.641.10.97264.473过热菜籽饼45.214.10.43238.3372.3外源酶对2种不同加热程度菜籽饼体外营养物质消化率的影响（见表3）由表3可知，正常菜籽饼的IVDMD、IVACPD、IVSCPD、IVDDMD、EHGE、IVGED分别为39.34%、66.27%、70.33%、51.75%、12.34 MJ/kg和60.53%；过热菜籽饼的IVDMD、IVACPD、IVSCPD、IVDDMD、EHGE、IVGED分别为33.08%、49.57%、53.29%、38.17%、8.58 MJ/kg和43.22%。正常菜籽饼的IVDMD、IVACPD、IVSCPD、IVDDMD、EHGE、IVGED均极显著高于过热菜籽饼（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.021.T003表3外源酶对2种不同加热程度菜籽饼体外营养物质消化率的影响项目IVDMD/%IVACPD/%IVSCPD/%IVDDMD/%EHGE/(MJ/kg)IVGED/%正常菜籽饼39.3466.2770.3351.75B12.34B60.53b正常菜籽饼添加外源酶39.0967.0471.0454.09A12.83A62.89a过热菜籽饼33.08d49.57D53.29D38.17d8.58d43.22d过热菜籽饼添加外源酶33.76c53.06C56.76C41.54c9.31c47.20cSEM0.171.531.540.220.010.17外源酶不添加35.8657.39R61.28R44.96R10.46R51.88R添加外源酶36.4260.55Z64.41Z47.82Z11.07Z55.05Z加热程度正常39.20X66.65X70.69X52.92X12.59X61.71X过热33.42Y51.08Y54.79Y39.85Y8.95Y45.21YP值外源酶0.2010.0100.0100.0100.0100.010加热程度0.0100.0100.0100.0100.0100.010外源酶×加热程度0.0350.0100.0100.1930.1050.051注：1.同列数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05）。2.A、B（a、b）表示外源酶对正常菜籽饼的影响差异，C、D（c、d）表示外源酶对过热菜籽饼的影响差异，X、Y（x、y）表示加热程度对菜籽饼的影响差异，Z、R（z、r）表示外源酶对菜籽饼的影响差异。外源酶添加影响了2种菜籽饼的养分消化率。正常菜籽饼添加外源酶的IVDDMD、EHGE比正常菜籽饼分别提高了4.52%、3.97%（P0.01），IVGED提高了3.90%（P0.05）。过热菜籽饼添加外源酶的IVDMD、IVDDMD、EHGE、IVGED分别比过热菜籽饼提高了2.06%、8.83%、8.51%、9.21%（P0.05），IVACPD、IVSCPD分别提高了7.04%、6.51%（P0.01）。3讨论3.1不同加热程度菜籽饼常规营养水平和总能分析本试验中，与正常菜籽饼相比，过热菜籽饼的CP含量高、EE含量低、CF含量高、ADF含量高、NDF含量高、GE含量低。原因可能与这两个菜籽饼的品种、来源及加工工艺有关。Slominski等[11]和彭健等[12]研究表明，过热处理会导致双低菜粕的ADF含量升高，显著降低有效赖氨酸的含量。席鹏彬等[13]研究发现，不同菜籽品种及不同榨油工艺对菜籽饼粕DM、CP、EE、ADF、NDF含量及GE具有显著影响，均与本试验研究结果一致。3.2不同加热程度菜籽饼加工过程表征参数分析适当加热可以破坏大豆及饼粕类饲料原料的抗营养因子，提高饲料的利用率，增加饲料香味，提高畜禽采食量；但是加热温度过高或加热时间过长，会损害蛋白质的营养价值，降低原料的养分消化率。本试验结果显示，过热菜籽饼的加工综合指数（PCI）为4，属于过度加工范畴，过热菜籽饼的活性赖氨酸及活性赖氨酸/总赖氨酸值比较低，表明热加工过程中，过热处理会导致氨基酸被破坏，并产生不能被生物利用的美拉德反应产物。美拉德反应是氨基酸的氨基和还原糖的缩合反应，赖氨酸是最易发生美拉德反应的氨基酸。原因是赖氨酸含有一个暴露在外的ε-氨基，能够与还原糖的羧基相结合[14]，其反应的缩合产物可以转变成希夫碱，经葡糖胺重排形成1-胺基-1去氧-2酮糖化合物。1-胺基-1去氧-2酮糖化合物是早期美拉德反应的赖氨酸集团的主要存在形式[15]，而晚期美拉德产物被称为类黑精。常规氨基酸检测方法不能检测出类黑精，导致样品中总赖氨酸含量的减少，从而降低可消化赖氨酸的含量。样品中未被任何饲料成分结合的赖氨酸被称为活性赖氨酸，可以被动物机体消化和利用。没有热加工处理的原料的总赖氨酸含量能够完全被消化和吸收，在这类原料中活性赖氨酸含量与总赖氨酸含量一致。而在热损伤蛋白中，测定的总赖氨酸中包含了部分来源于1-胺基-1去氧-2酮糖化合物的赖氨酸，这样会高估其中可消化赖氨酸的含量，所以活性赖氨酸的测定是指示加热过度的重要指标之一。Malgorzata等[16]报道，过热加工会降低饲料原料赖氨酸含量及营养物质消化率，与本试验研究结果一致。3.3不同加热程度对菜籽饼体外营养物质消化率的影响本试验结果表明，正常菜籽饼的IVDMD、IVACPD、IVSCPD、IVDDMD、EHGE和IVGED分别比过热菜籽饼高6.26%、16.7%、17.04%、13.58%、3.76 MJ/kg、17.31%。原因可能是源头上不同品种、不同地区菜粕品质有差异，还可能是加热过度引起的消化率降低。兰云贤等[17]指出，加工过程中温度过高可能会导致如棉仁饼、花生饼等饼粕类原料发生美拉德反应，降低其营养物质利用率。彭健等[18]研究发现，高温处理的菜粕粗蛋白质消化率会显著降低。Gonzalez-Vega等[19]研究发现，125 ℃高压蒸汽处理会显著降低豆粕CP及AA消化率。赵谋明等[20]对发生美拉德反应的花生分离蛋白进行体外模拟消化试验，结果显示，模拟消化产物中分子量较大的肽段含量随着热处理及美拉德反应的发生而增加，导致能够透过透析袋的小分子蛋白质含量减少，进而影响其体外表观粗蛋白质消化率。此外粗纤维也是影响畜禽养分消化率的重要因素之一[21]。Slominski等[11]对菜籽饼粕化学特性进行研究，结果显示，过热处理会增加饼粕类原料中与粗纤维相连蛋白质的含量，进而降低有效赖氨酸及蛋白消化率。以上研究均与本试验研究结果相一致。3.4外源酶对2种菜籽饼体外营养物质消化率的影响日粮中添加外源酶制剂能够有效提高饲料利用率[22]，如外源蛋白酶可以通过断裂肽键，破坏蛋白质的一级结构，从而将饲料中大分子蛋白质水解成小分子多肽和氨基酸，提高消化率[23]。张立兰等[24]研究显示，在肉鸡饲粮中添加外源蛋白酶，可显著提高其体外DMD、GED和EHGE。吴诗樵[25]研究显示，外源蛋白酶添加对棉粕、玉米、DDGS等鸡常用饲料原料表观氨基酸消化率和标准氨基酸消化率均具有促进作用。淀粉酶可催化淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖及糊精。张宪等[26]研究发现，外源淀粉酶添加提高肉鸡饲粮胃阶段IVDMD、IVGED，提高全消化道IVACPD、IVSCPD及体外代谢能（IVME）。本研究利用SDS-Ⅲ建立肉鸡体外模拟消化模型，探究外源酶蛋白酶Proact和淀粉酶A酶对2种不同加热程度菜籽饼全消化道的酶解效果，结果显示，添加外源酶的过热菜籽饼的IVDMD、IVDDMD、EHGE、IVGED显著高于不添加外源酶的过热菜籽饼，IVACPD、IVSCPD极显著高于不添加外源酶的过热菜籽饼；添加外源酶的正常菜籽饼IVACPD、IVSCPD与不添加外源酶的正常菜籽饼相比虽有提高但差异不显著，而IVDDMD、EHGE极显著高于不添加外源酶的正常菜籽饼，IVGED显著高于不添加外源酶的正常菜籽饼。研究表明，额外补加外源酶对养分消化率的提高具有正面影响，尤其是对发生美拉德反应的饲料原料消化率改善作用更明显，可能是外源酶对美拉德反应产物有一定的降解释放作用，但其具体作用机理需进一步研究。4结论正常菜籽饼的IVDMD、IVACPD、IVSCPD、IVDDMD、EHGE和IVGED均高于过热菜籽饼，为更加优质的菜籽饼来源。额外补加外源酶后均可提高2种菜籽饼的养分消化率，但以过热菜籽饼养分消化率的提高幅度更大，表明添加外源酶对过热加工原料养分消化率的改善作用更明显，可能是外源酶对美拉德反应产物有一定的降解释放作用，但具体作用机理需进一步研究。