仔猪早期断奶可提高母猪生产效率，但早期断奶仔猪易受到环境应激，导致消化道微生态紊乱，从而降低仔猪消化吸收能力，甚至产生腹泻等疾病，影响仔猪生长发育。抗生素对仔猪断奶应激具有良好的治疗效果，但大量使用会引起仔猪肠道中细菌产生极强的耐药性[1]。我国自2020年7月1日起，停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料[2]。酵素作为具有促进消化吸收[3]、抗氧化[4-5]、调节肠道菌群[6-7]、增强机体免疫能力[8]等作用的富含活性物质的复合产物，已在人类生活中得到广泛应用，但酵素产品作为抗生素替代品在畜禽生产中应用仍处于起步阶段。菠萝酵素（PE）是采用耐酸性高、产有机酸多的乳酸菌对菠萝榨汁发酵获得的一种绿色饮水添加剂。发酵后的产品富含乳酸、植物乳杆菌、小肽、菠萝蛋白酶等生物活性成分。PE属于绿色环保型添加剂，且不影响环境和畜禽品质，对人类健康无危害。目前，有关PE的研究大多集中于生物活性，PE在动物生产中的应用报道较少[9-10]。本试验拟研究饮水中添加PE对断奶仔猪生长性能、抗氧化、免疫指标和粪便菌群的影响，以期为酵素在预防仔猪断奶应激提供参考。1材料与方法1.1试验材料PE购自广州格拉姆生物科技有限公司，为液态混合物。植物乳杆菌活性≥5×108 CFU/kg、乳酸≥100 g/kg、柠檬酸≥10 g、产朊假丝酵母蛋白≥2 g、叶酸≥3.2 mg、维生素C≥0.8 mg。1.2试验设计选取120头体重为（8.06±0.25）kg的“长×大”断奶仔猪，随机分为4组，每组3个重复，每个重复10头猪。各组断奶仔猪均饲喂基础日粮，参照NRC（2012）配制。基础日粮原料组成及营养水平见表1。对照组（CON组）仔猪饮水无添加剂，PE1组、PE2组、PE3组仔猪饮水中分别添加0.1%、0.2%、0.3%的PE。试验期间所有仔猪自由饮水。PE组24 h通过自动比例泵添加菠萝酵素。试验期28 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米54.00消化能/(MJ/kg)14.37豆粕14.00粗蛋白质/%18.96膨化大豆12.00钙/%0.90鱼粉6.00总磷/%0.43乳清粉6.00有效磷/%0.35豆油3.00赖氨酸/%1.35石粉1.00蛋氨酸/%0.39预混料4.00苏氨酸/%0.77注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 12 000 IU、VD3 2 500 IU、VE 30 IU、VK3 3 mg、VB12 12 μg、泛酸15 mg、烟酸40 mg、铜9 mg、锌100 mg、锰55 mg、硒0.3 mg、碘0.35 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余为实测值。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验第0、28 d，仔猪禁食12 h后分别称重，分别记为初重（IBM）、末重（FBM），每日记录各重复消耗的饲料量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）及料重比（F/G）。ADG=(FBM-IBM)/试验天数(1)ADFI=(饲喂量-剩余量)/试验天数(2)F/G=ADFI/ADG(3)1.3.2血清抗氧化、免疫指标试验第28 d，每个重复选择2头仔猪前腔静脉采血10 mL，4 000 r/min离心10 min，得到血清后分装并保持于-20 ℃，用于检测血清抗氧化指标及免疫指标。试剂盒购自南京建成生物工程研究所，测试过程完全按照试剂盒说明书步骤进行[11]。抗氧化指标包括：总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛(MDA)、过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）。免疫指标包括：免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）及促炎症因子干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。1.3.3粪便微生物群分析试验结束前1 d，每个重复中采集新鲜未接触地面的粪便样品，用无菌牙签采取样品中段内部，分装至2 mL冻存管中，每管粪便量为0.5~2.0 g，每个样品分装2~3管备份，分装好后样本迅速放入液氮中速冻，用于检测粪便菌群指标。粪便样本送至北京奥维森基因科技有限公司进行检测，获取检测数据后，对数据进行多样性分析、物种分类注释和差异分析。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1PE对断奶仔猪生长性能的影响（见表2）由表2可知，PE2组和PE3组断奶仔猪的ADG显著高于CON组（P0.05），各PE组的F/G均显著低于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T002表2PE对断奶仔猪生长性能的影响组别IBM/(kg/头)FBM/(kg/头)ADG/[g/(头·d)]ADFI/[g/(头·d)]F/GCON组8.06±0.2721.06±1.25b464.05±45.37b728.75±16.95a1.57±0.06aPE1组8.06±0.2420.54±0.88b445.71±32.93b649.29±3.25b1.46±0.03bPE2组8.05±0.2622.85±0.57a528.51±23.08a723.04±10.65a1.37±0.03bPE3组8.07±0.2622.60±1.59a519.17±56.66a714.82±26.90a1.38±0.07b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3~表6与此同。2.2PE对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响（见表3）由表3可知，与CON组相比，各PE组仔猪血清T-AOC显著提高（P0.05）；PE2组仔猪血清SOD活性显著提高（P0.05），MDA含量显著降低（P0.05）；PE2组和PE3组仔猪血清CAT活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T003表3PE对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响组别T-AOC/(U/mL)MDA/(μmol/L)SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)CAT/(U/mL)CON组3.64±0.26b7.36±0.98a20.19±0.39b320.00±25.3612.20±4.08bPE1组4.42±0.28a6.53±0.70a20.75±0.80ab387.37±66.9011.33±3.84bPE2组4.72±0.43a4.03±0.41b21.16±0.48a395.41±65.8019.44±0.19aPE3组4.52±0.12a7.08±0.35a20.75±0.65ab355.46±74.0616.52±0.86a2.3PE对断奶仔猪血清免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与CON组相比，PE2组和PE3组仔猪血清IgM、IgA和TNF-α含量显著提高（P0.05），PE2组仔猪血清IFN-γ含量显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T004表4PE对断奶仔猪血清免疫指标的影响组别IgM/(mg/L)IgG/(mg/L)IgA/(mg/L)IFN-γ/(ng/L)TNF-α/(ng/L)CON组11.64±1.39b73.65±22.9924.88±3.86c711.25±51.13b209.32±72.01bPE1组13.18±1.19ab88.17±21.0228.35±4.88bc740.92±77.52b223.60±49.92bPE2组14.87±2.10a90.15±15.6834.11±1.93a856.88±59.77a307.99±56.41aPE3组14.81±2.06a90.69±24.1230.05±5.82ab803.25±151.55ab288.83±40.63a2.4PE对断奶仔猪粪便菌群的影响2.4.1OTU聚类分析本试验对每组3个样品的Miseq测序后得到有效数据1 732 060条，在进一步筛选后得到优质数据1 650 381条，对优质数据按97%序列相似度进行聚类后，4组共得到10 981个OTU，平均每个样品为915个OTU。样品稀释曲线见图1。对试验各组样品的OTU利用R语言工具进行分析，得到Venn图，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F001图1样品稀释曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F002图2Venn图由图1可知，试验中各组数据稀释曲线趋于平稳状态，表明测序的深度和数据量足够，能够基本反映样品中细菌的组成和种类。由图2可知，各组菌群结构具有相似性，同时又具有相对独立性。4组共有777个操作分类单元（OTUs），CON组有92个特征OTUs，PE1组有124个特征OTUs，PE2组有43个特征OTUs，PE3组有119个特征OTUs。2.4.2PE对断奶仔猪肠道微生物物种Alpha多样性的影响（见表5）Chao1指数和Shannon指数共同反映粪便中微生物区系的Alpha多样性，其中Chao1指数反映群落的丰富度，Shannon指数反映群落的多样性[12]。由表5可知，仔猪饮水中添加PE后，粪便微生物Shannon指数有所升高，表明PE可影响仔猪肠道微生物多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T005表5PE对断奶仔猪肠道微生物物种Alpha多样性的影响组别Chao1指数Shannon指数CON组1 218.79±220.126.42±0.94PE1组1 243.76±178.897.00±0.56PE2组1 061.24±29.196.95±0.04PE3组1 108.03±126.807.02±0.202.4.3Beta多样性分析（见图3、图4）Beta多样性分析是对不同微生物群落间的物种多样性进行组间比较，以明确不同样品组间的群落组成相似性或差异性；PCoA主坐标分析是基于距离矩阵来寻找主坐标，样本点距离远近代表了样本中微生物群落的相似性，距离越近，相似度越高[13]。由图3可知，CON组与各PE组各自相对聚集，区分良好。PCoA主坐标PC1解释百分比为26.76%，PC2解释百分比为16.45%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F003图3不同处理组粪便微生物OTU水平PCoA分析NMDS非度量多维尺度分析是一种以样品（任何类型距离）距离矩阵为基础的排序方法。当分析目标只是为了反映样品顺序，不强调样品间距离，非度量多维尺度分析就显得非常实用。NMDS分析中同组样本点距离远近说明了样本的重复性强弱，不同组样本的远近反应组间样本距离在秩次（数据排名）上的差异。由图4可知，CON组和各PE组均相对聚集，表明各组组内群落重复性较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F004图4不同处理组粪便微生物NMDS分析2.4.4物种相对丰度分析2.4.4.1PE对断奶仔猪粪便微生物门水平上相对丰度的影响（见图5、表6）由图5、表6可知，统计各组物种相对丰度大于1%的菌门，CON组菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）53.37%和拟杆菌门（Bacteroidetes）45.09%。PE1组菌门分别为厚壁菌门55.50%、拟杆菌门41.83%和软壁菌门（Tenericutes）1.37%。PE2组菌门分别为厚壁菌门51.79%、拟杆菌门45.20%和放线菌门（Actinobacteria）1.19%。PE3组菌门分别为厚壁菌门51.27%、拟杆菌门44.66%和螺旋体门（Spirochaetae）1.87%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F005图5PE对断奶仔猪粪便微生物门水平上相对丰度的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T006表6各组样品在门水平上的物种丰度组别厚壁菌门拟杆菌门软壁菌门放线菌门螺旋体门CON组53.37±11.6645.08±11.380.45±0.300.48±0.340.12±0.16PE1组55.50±1.5641.83±2.191.37±0.570.59±0.320.23±0.20PE2组51.79±6.1545.20±6.940.49±0.351.19±0.310.97±0.45PE3组51.26±4.4644.66±9.100.52±0.560.56±0.331.87±2.76%各组样本优势菌群均为厚壁菌门和拟杆菌门，其总和占样本中细菌总数的95%以上，组间菌门分布相似。2.4.4.2PE对断奶仔猪粪便微生物属水平上相对丰度的影响（见图6、表7）由图6、表7可知，统计各组物种相对丰度占比前五的菌属，CON组菌属分别为未知（unidentified）16.21%、巨单胞菌属（Megamonas）9.97%、普氏菌属NK3B31组（Prevotellaceae_NK3B31_group）8.42%、普雷沃菌属_1（Prevotella_1）6.91%和普雷沃菌属_9（Prevotella_9）6.65%。PE1组的菌属分别为未知18.69%、普氏菌属NK3B31组13.74%、瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）5.11%、理研菌科RC9肠道组（Rikenellaceae_RC9_gut_group）4.90%和异形藻属（Alloprevotella）4.01%。PE2组的菌属分别为未知16.26%、普氏菌属NK3B31组14.66%、巨单胞菌属5.44%、普雷沃菌属_9 4.96%和普雷沃菌属_1 3.85%。PE3组的菌属分别为未知13.66%、普氏菌属NK3B31组13.39%、乳杆菌属（Lactobacillus）7.31%、普雷沃菌属_9 6.64%和瘤胃球菌科_UCG-005 5.18%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.F006图6PE对断奶仔猪粪便微生物属水平上相对丰度的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.005.T007表7各组样品在属水平上的物种丰度项目CON组PE1组PE2组PE3组未知16.20±6.5518.69±2.0416.26±5.3213.66±2.45巨单胞菌属9.97±13.660.83±1.195.44±2.400.22±0.36普氏菌属NK3B31组8.42±4.7613.74±5.3114.66±5.3713.39±7.43普雷沃菌属_16.91±3.023.37±2.113.85±1.205.07±2.45普雷沃菌属_96.65±5.330.95±0.724.96±5.486.64±9.11瘤胃球菌科_UCG-0053.58±3.875.11±2.172.50±0.275.18±1.21理研菌科RC9肠道组2.95±4.494.90±2.143.53±2.335.14±7.46异形藻属3.52±1.454.01±1.253.76±1.063.20±1.34乳杆菌属2.16±3.650.82±0.301.99±1.307.31±6.16大肠杆菌属0.002 8±0.000 30.002 0±0.001 50.000 4±0.000 60.000 3±0.000 2%与CON组相比，各PE组的巨单胞菌属的相对丰度有所降低，普氏菌属NK3B31组相对丰度有所升高，但差异均不显著（P0.05）。PE3组的乳杆菌属的相对丰度高于对照组，大肠杆菌属（Escherichia）的相对丰度低于对照组。3讨论3.1PE对断奶仔猪生长性能的影响断奶仔猪的营养吸收状况可由生长性能进行直观判断。仔猪断奶时，因其消化系统尚未发育完全，且生活环境、饮食等发生改变，极易造成仔猪产生应激，导致生长发育缓慢，生长性能降低[14]。研究发现，酵素中的乳酸菌、蛋白酶、淀粉酶、乳酸等活性物质对畜禽具有促生长作用[15-16]。张超峰[17]研究发现，给生长猪饲喂0.6%酸美酵素有效提高ADG，降低F/G，但并未对ADFI产生影响。徐绅烜等[18]在日粮中添加1%酸美酵素，发现仔猪F/G降低，ADG提高，并降低了死亡率和腹泻率。黄爱霞[19]研究发现，在断奶仔猪日粮中添加和美酵素提高了生长性能和饲料转化率，对ADFI无影响。刘海燕等[20]研究发现，在日粮中添加酵素提高了育肥羊ADG，降低了F/G，但对ADFI无影响。本试验中，PE1组断奶仔猪ADFI较CON组有所降低，ADG与CON组无差异；PE2组和PE3组断奶仔猪的ADFI与CON组相比差异不显著，而ADG较CON组显著提高；各PE组仔猪F/G较CON组均有所降低，表明PE可减少仔猪断奶应激，提高仔猪饲料转化效率，进而提高仔猪生长性能，以添加0.2% PE效果最好。结合本试验结果与前人结论，酵素产品对不同畜禽采食量均无影响，酵素中的活性物质仅促进动物体胃肠道对营养物质的消化吸收。3.2PE对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响T-AOC的主要作用是调节体内活性氧的动态平衡。MDA可反映机体内脂质过氧化和细胞受损的程度，当MDA含量过高会对细胞造成毒害作用[21]。机体在新陈代谢过程产生的多种氧化自由基会导致细胞发生氧化应激性损伤，甚至给动物机体造成严重损伤。SOD是活性氧水平的中心调节剂，可催化超氧化物分解成为过氧化氢（H2O2）和水[22]。但SOD循环半衰期较短，限制了生物利用度，导致其治疗应用有限[23]。研究表明，益生菌可协助SOD的局部输送[24]。GSH-Px是重要的抗氧化酶类物质，CAT是生物防御系统中的关键酶，为机体提供抗氧化防御和保护作用，可分解H2O2参与细胞抗氧化防御，阻止Fenton反应产生羟基自由基[25]。喻红波[26]发现，断奶仔猪血清T-AOC和SOD活性提高、MDA含量降低与其补饲和美酵素有关。董延江等[27]试验发现，本草酵素可替代抗生素提高仔猪抗氧化水平，补饲本草酵素的仔猪血清GSH-Px、SOD的活性和MDA含量、T-AOC与饲喂抗生素的仔猪均无显著差异。本试验中，各PE组断奶仔猪血清T-AOC及SOD、GSH-Px、CAT活性均高于CON组，MDA低于CON组，表明PE有利于提高断奶仔猪抗氧化能力。PE2组的效果优于PE1和PE3组，说明适宜的PE添加量更利于调节断奶仔猪体内活性氧的动态平衡、减少脂质过氧化、清除体内自由基。综合本试验结果和前人结论，酵素产品均具有很强的抗氧化性，可提高机体内抗氧化相关指标活性，清除机体内过氧化物质。3.3PE对断奶仔猪血清免疫指标的影响高等动物免疫淋巴细胞可产生免疫球蛋白，免疫球蛋白在抗原刺激下可转化为抗体，发挥抗病原菌和病毒等功能，血清免疫蛋白含量升高表明机体免疫功能增强[28]。IFN-γ具有免疫调节、抗病毒和抗肿瘤作用，可由活化的T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生[29-30]。研究表明，TNF-α升高表示机体具有炎症反应，超生理水平的TNF-α对细胞活动有害，导致各种病理条件，但完全去除TNF-α不太可能对细胞产生保护作用。近年来，有研究发现，TNF-α在基础/生理条件下对细胞具有重要的保护作用，TNF-α对Nrf2/ARE转录途径的基础激活是必要和充分，TNF-α与机体正常抗氧化活动密切相关，可与淋巴B细胞协同发挥抗肿瘤作用[31-32]。本试验中，PE组断奶仔猪血清IgM、IgG、IgA含量均高于CON组，说明PE对仔猪免疫功能改善效果明显，PE组断奶仔猪血清中促炎性因子IFN-γ和TNF-α含量较CON组有所提高，但均处于正常生理水平内，表明这两个指标增加没有给机体带来不利影响。PE2组的效果优于PE1和PE3组，说明适宜的PE浓度更利于增强断奶仔猪免疫功能。这与董延江等[27]试验中给断奶仔猪补饲3%本草酵素较抗生素组血清IgM、IgG、IgA含量均显著提高以及黄爱霞[19]试验中和美酵素可提高断奶仔猪血清IgM、IgG、IgA含量的结果一致。目前，有关酵素产品对畜禽免疫功能的影响多测定血清指标，对畜禽免疫器官的研究较少，可作为后续研究方向。3.4PE对断奶仔猪粪便菌群结构的影响动物体肠道内菌群种类和数量变化错综复杂，受日龄、遗传、营养和养殖环境等多因素的影响[33-35]。研究表明，肠道微生物群落的稳定和改善宿主健康状况与肠道菌群多样性密切相关，多样性指数越高，菌群区系平衡越不容易被破坏[36-38]。本试验发现，饮水添加PE增加了PE1组和PE3组的特征OTUs数量，表明PE可改善断奶仔猪肠道健康，有助于维持肠道菌群平衡。厚壁菌门细菌参与能量吸收，促进机体从饲料中吸收能量，从而满足机体生长需求；拟杆菌门细菌参与碳水化合物、胆汁酸、类固醇的代谢，能够提高营养物质的利用率，与肠黏膜修复、免疫发育及肠道微生态平衡等密切相关[39]。乳酸菌属可产生抗菌物质，诱导黏附素分泌或阻止细胞凋亡，增强肠道屏障功能，从而保护肠道健康[40]。大肠杆菌属是条件致病菌，在一定条件下可引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染[41]。马翠等[42]研究发现，厚壁菌门和拟杆菌门为妊娠期到哺乳期母猪的优势菌门，与本试验发现的断奶仔猪优势菌门结果相同，均以厚壁菌门和拟杆菌门为主，饮水中添加PE对断奶仔猪门水平丰度无影响。赵菲等[43]发现，给小鼠灌服羊栖菜酵素可提高肠道乳杆菌属和双歧杆菌属丰度，降低肠道中幽门杆菌属丰度。张鹏宇[44]通过大鼠试验表明，灌服苹果酵素和桑葚酵素均可提高肠道中的乳杆菌属丰度。本试验中，PE3组特征OTUs数量多于CON组，粪便乳杆菌属相对丰度高于CON组，大肠杆菌属相对丰度低于CON组，同时生长性能和表观消化率均优于CON组。结果表明，PE作用于断奶仔猪肠道菌群，改善菌群环境，提高仔猪饲料转化率。可能是因为PE中的乳酸、植物乳杆菌等物质共同发挥作用，为肠道内益生菌创造出更适宜的生长环境，并建立了新的菌群平衡。4结论本研究结果表明，在断奶仔猪饮水中添加适宜剂量的PE可以改善生长性能，提高抗氧化能力和免疫力，改善肠道菌群环境，断奶仔猪饮水中添加PE的推荐含量为0.2%。