鸡球虫病是一种发病率高、感染力强的寄生虫病，可引起雏鸡的生长缓慢以及死亡[1]。目前，国内已知的艾美耳球虫有7种，其中柔嫩艾美尔球虫的毒力最强，一旦侵入机体极易导致雏鸡患病并传染给同一环境中的其他雏鸡[2]。鸡球虫病临床常见症状有情绪低落、鸡毛乱、易掉毛、对进食不感兴趣、缩颈闭目、活动能力下降、粪便中有鲜血流出、肠道黏膜溃烂脱落等，且在组织切片中可发现回肠处出血。不同年龄段的鸡感染症状存在明显差异，雏鸡易昏睡，不能久站，喜卧于笼中，2~3 d内死亡，致死率高；成年鸡病期比较久，通常无明显临床表现，以生长速度慢、产卵减少等为主[3]。鸡球虫病对鸡养殖生产具有较大危害，能够严重影响养殖户的经济效益[4]。纳米氧化锌是一种新型高功能精细无机产品，在磁、光、电、敏感等方面具有一般ZnO产品无法比拟的特殊性能和新用途[5]。使用普通氧化锌饲喂动物能够补充相应的营养物质，但吸收不够稳定[6]。主要是由于动物消化道的消化液会与药物发生一些对机体有害的反应。为解决该问题，可在动物饲料中加入吸收率较高、渗透性强、量小高效的纳米氧化锌[7]。高剂量氧化锌在幼龄动物生产中能够增加采食量，促进营养物质消化吸收，保护肠上皮屏障，影响肠道菌群，抑制幼龄动物腹泻，提高增重效率，但过高剂量氧化锌对动物具有毒副作用，可造成环境污染；使用多孔氧化锌、纳米氧化锌和包被氧化锌等不同形式可降低氧化锌的用量，同时保证氧化锌的生理作用[8]。目前，有关纳米氧化锌对球虫感染雏鸡的影响的相关报道较少。本试验研究纳米氧化锌颗粒对球虫感染雏鸡生长发育、生化指标的影响，为鸡球虫病的防治提供参考。1材料与方法1.1试验材料丙二醛、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、血尿素氮试剂盒购自南京建成生物工程研究所。纳米氧化锌（20~30 nm，含量99.0%~99.5%）购自上海麦克林生化科技技术有限公司。羧甲基纤维素钠（分析纯）购自湖北成丰化工有限公司。DK-S24型电热恒温水浴锅购自上海精密仪器仪表有限公司，XW-80A微型旋涡混合器购自深圳市三莉科技有限公司，DT-500B型电子天平购自上海绩泰电子科技有限公司。1.2试验方法选择50只健康的8日龄雏鸡随机分为5组，每组10只鸡。试验期21 d。各组雏鸡均饲喂基础日粮，对照组、感染组雏鸡灌胃生理盐水0.5 mL/只，纳米氧化锌组雏鸡分别灌胃0.5 mL 10、20、40 mg/kg纳米氧化锌。灌胃14 d后进行球虫攻虫，除对照组外其余每组每只雏鸡采用5×104个球虫卵囊经口内攻毒。攻毒7 d后，采集全部试验动物的粪便、血液以及脏器，进行指标检测。试验使用基础日粮为正大集团的肉鸡料（产品代码：CPC-BF-H52），营养水平为代谢能11.95MJ/kg、粗蛋白质19.03%、赖氨酸0.97%、蛋氨酸0.36%、钙0.92%、有效磷0.41%、钠0.16%、氯0.17%（代谢能为计算值，其余为实测值）。1.3测定指标及方法1.3.1体重试验鸡分别于灌胃第0、4、8、12、16 d称重并详细记录数据。1.3.2粪便中球虫卵囊数试验第21 d，以组为单位收集鸡粪便，并计算鸡群粪便中的球虫卵囊数。试验采用麦克马斯特法将2 g新鲜鸡粪放入100 mL洁净的烧杯中，加入8 mL饱和盐，用一根玻璃棒捣碎，拌匀；加50 mL饱和盐，搅拌好后立即用纱布过滤；将滤液注射到2只麦克马斯特虫卵计数板中，在显微镜平台上放置3~5 min，在10倍物镜下进行镜检，计数室的规格是10×10，容积为1 cm×1 cm×0.15 cm=0.15 mL，数出计数室10个对角线格子的卵囊值，相加乘以10得出n1和n2；计算OPG值（即1 g粪便中的卵囊数量）。OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60/2(1)1.3.3血清生化指标试验第21 d，各组雏鸡采血注入10 mL的离心管中，4 000 r/min离心10 min，用移液枪将血清转移至新的离心管中，4 ℃保存，用于测定血清生化指标。血清生化指标包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、丙二醛、尿素氮，操作方法参考试剂盒说明书。1.3.4肠道损伤情况试验第21 d，按顺序采集对各组雏鸡回肠样本，采集样本放入福尔马林固定液中固定，使用石蜡包埋制作组织切片，HE染色，观察肠道情况。1.3.5脏器指数试验第21 d，采集全部试验组的所有雏鸡，分离肝脏、脾脏、法氏囊，剔除脂肪组织并称重，记录并计算相应指数。脏器指数=脏器重/活体重(2)1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡体重的影响（见表1）由表1可知，灌胃0 d时，各组雏鸡体重差异不显著（P0.05）；灌胃4 d时，感染组雏鸡体重与灌胃不同浓度纳米氧化锌组差异不显著（P0.05），对照组雏鸡体重显著低于其他组（P0.05）；灌胃8 d时，20 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡体重显著低于感染组（P0.05）；灌胃12 d时，40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡体重有升高，但与感染组相比差异不显著（P0.05）；灌胃16 d时，40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡体重显著高于感染组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.T001表1纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡体重的影响组别0 d4 d8 d12 d16 d对照组54.90±1.3475.50±1.05b113.20±16.61c149.30±23.44c241.00±37.73a感染组57.40±1.1384.00±2.09a130.30±9.05a170.30±11.96a216.61±27.15c10 mg/kg纳米氧化锌组56.18±2.1082.16±1.70a127.70±10.74a161.50±20.59b218.70±38.93c20 mg/kg纳米氧化锌组55.83±2.0681.00±2.24a120.70±9.61b171.10±13.00a205.40±19.03d40 mg/kg纳米氧化锌组56.83±2.1083.67±1.93a126.58±8.98a175.16±11.63a231.50±23.58b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表4与此同。g/只2.2纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡粪便中卵囊数的影响（见表2）由表2可知，对照组未检出虫卵。10 mg/kg纳米氧化锌组和40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡粪便中卵囊数均显著低于感染组（P0.05），且以40 mg/kg纳米氧化锌组最低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.T002表2纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡粪便中卵囊数的影响项目对照组感染组10 mg/kg纳米氧化锌组20 mg/kg纳米氧化锌组40 mg/kg纳米氧化锌组卵囊数015 533±3 557b10 933±2 732c18 400±4 320a5 166±1 418d注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。个2.3纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡脏器指数的影响（见表3）由表3可知，与感染组相比，加入不同剂量的纳米氧化锌使雏鸡的肝脏指数均有所回升，但各组间差异不显著（P0.05）。感染组雏鸡脾脏指数显著高于对照组（P0.05），20 mg/kg纳米氧化锌组、40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡的脾脏指数显著高于感染组（P0.05）。感染组雏鸡的法氏囊指数显著低于各纳米氧化锌组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.T003表3纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡脏器指数的影响组别肝脏指数脾脏指数法氏囊指数对照组0.033 1±0.003 40.001 70±0.000 08c0.005 2±0.001 6a感染组0.036 1±0.006 20.002 20±0.000 10b0.002 5±0.000 9c10 mg/kg纳米氧化锌组0.039 1±0.005 20.002 10±0.000 14b0.003 3±0.001 4b20 mg/kg纳米氧化锌组0.040 2±0.002 60.002 70±0.000 23a0.002 7±0.001 0b40 mg/kg纳米氧化锌组0.038 0±0.000 50.002 70±0.000 50a0.002 7±0.003 0bg/kg2.4纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡血清生化指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，感染组雏鸡血清谷丙转氨酶活性显著降低（P0.05）；与感染组相比，40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡血清谷丙转氨酶活性显著升高（P0.05），雏鸡血清谷草转氨酶活性显著降低（P0.05），10 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡血清谷草转氨酶活性显著升高（P0.05）。球虫攻毒使雏鸡血清肌酐含量升高，各纳米氧化锌组雏鸡血清肌酐含量均显著低于感染组（P0.05）。20、40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡血清丙二醛含量均显著高于感染组（P0.05）。40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡血清中尿素氮含量显著高于感染组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.T004表4纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡血清生化指标的影响组别谷丙转氨酶/(U/L)谷草转氨酶/(U/L)肌酐/(μmol/L)丙二醛/(μmol/L)尿素氮/(mmol/L)对照组13.66±3.33a51.78±14.63c532.98±219.97c4.81±1.40c1.53±0.77c感染组4.61±4.03c70.12±20.41b724.00±128.24a4.77±2.07c1.87±0.72b10 mg/kg纳米氧化锌组2.10±2.13d85.77±19.89a579.90±345.87b4.10±0.70c2.91±1.13b20 mg/kg纳米氧化锌组4.06±2.95c70.19±22.44b551.90±264.05c5.65±1.42a2.09±0.68b40 mg/kg纳米氧化锌组6.45±0.78b50.30±11.70c515.74±405.83d5.16±1.46b3.16±1.99a2.5纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡回肠肠道损伤的影响（见图1）由图1可知，对照组雏鸡回肠组织结构良好，内含大量绒毛，内壁肌层内的纵肌清晰可见，肠管内绒毛结构完整，没有倒伏，肠绒毛被一层完整的柱状上皮细胞所覆盖，柱状细胞以圆柱形为主，排列紧密，结构清晰，呈高脚杯形，上端膨大，下端细，多分布于肠腺附近。图1纳米氧化锌对球虫攻毒雏回肠鸡肠道损伤病理切片结果（400×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.F1a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.F1a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.F1a410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.008.F1a5感染组雏鸡回肠肠壁有脱落、水肿、小肠组织局部增厚、小肠绒毛破裂、倒状显著；高倍镜下可见大量杯状细胞密集、杂乱排列，小肠绒毛中轴间隙增大。10 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡回肠肠壁有增厚和水肿现象，肠壁有脱落，肠绒毛有断裂和倒状，肠绒毛中轴增大，杯状细胞密集且紊乱排列。20 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡回肠肠壁有脱落和增厚，肠绒毛有断裂，出现的空泡可能是由于处理标本时黏液颗粒丢失，杯状细胞密集且紊乱。40 mg/kg纳米氧化锌组雏鸡回肠肠壁结构较为完整，肠绒毛有断裂，杯状细胞密集且紊乱排列，绒毛中轴增大。各攻毒组的核密度与对照组相比均有不同程度增大。3讨论鸡球虫病是艾美耳属原虫，可侵害宿主肠上皮，从而引起具有致死性的急性肠道寄生虫病，传播范围广，感染率高[9]。目前，抗球虫药耐药机制的研究已逐步深入，但仍然无法解决耐药性的问题。因此，寻求一种新型抗球虫药仍是现在研究球虫病的重点之一。3.1纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡体重的影响添加氧化锌可提高幼龄动物的体重。魏可健[10]研究发现，日粮中添加1 000、1 500 mg/kg纳米氧化锌，仔猪的体增重明显高于500 mg/kg纳米氧化锌组。本试验中，添加纳米氧化锌能够缓解球虫攻毒导致的体重下降。陈培荣等[11]研究发现，日粮中添加3%复方抗球虫中药添加剂能够提高球虫感染肉鸡的体增重。徐立新等[12]研究表明，口服纳米氧化锌提高使感染球虫后雏鸡体重，与本试验结果一致。研究发现，纳米氧化锌对肉鸡的促生长作用具有阶段性与时效性，1~2周龄时以添加400 mg/kg为宜，2~3周龄以200 mg/kg最好，3~4周龄以100 mg/kg纳米氧化锌组生长性能最佳[13]。3.2纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡粪便中卵囊数的影响本试验结果显示，40 mg/kg纳米氧化锌组的卵囊数明显低于感染组、10 mg/kg纳米氧化锌组和20 mg/kg纳米氧化锌组，表明纳米氧化锌可在一定程度上起到抗球虫感染的作用，与徐立新等[12]研究口服纳米氧化锌可降低感染球虫后雏鸡体内的虫卵数量的结果一致。有研究表明，纳米氧化锌改善鼠感染球虫后引起的杯状细胞减少，同时可减少卵囊排出[14]。口服感染1×104堆型艾美耳球虫的雏鸡经20 mg/kg纳米氧化锌治疗后，可提高存活率，减轻肠道损伤，抗球虫指数可达180[15]。3.3纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡脏器指数的影响脏器指数主要用于评价被测试的物质作用于靶器官产生的影响，若器官质量以及器官与机体的质量之比有所下降，说明器官萎缩，器官功能下降，有退化的表现；若器官质量以及器官与机体的质量之比有所增高，说明该器官可能发生了充血和水肿，出现了增生性肥大[16]。本研究中，不同浓度纳米氧化锌添加组雏鸡的脾脏、肝脏、法氏囊的脏器指数与感染组相比均有不同程度的增高，说明纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡造成的器官萎缩、功能减退具有一定的修复作用。其中，肝脏指数的增高程度最大，且效果最显著的剂量组是20 mg/kg纳米氧化锌添加组。对照组的法氏囊指数最大可能是因为感染球虫使各灌胃组鸡的法氏囊功能受到抑制；而对照组的肝脏指数和脾脏最低可能是因为肝脏和脾脏本身的保护功能，肝具有解毒作用，脾脏和淋巴细胞和免疫应答密切相关，所以各感染组的肝脏和脾脏为抵抗病变而比对照组更发达。杨雯等[17]发现，艾美耳球虫的孢子化卵囊与禽流感疫苗结合使用可促进脾脏、法氏囊生长，特别是对法氏囊的早期生长具有一定的促进作用。3.4纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡血清生化指标的影响肝脏组织细胞内存在谷丙转氨酶，当肝脏组织细胞出现损伤时，这种酶的活性会增加。谷草转氨酶存在于肾组织，在正常情况下含量很少，但细胞损伤时谷草转氨酶的活性就会增加。肾小球的滤过功能可通过测定血肌酐浓度显示，一旦肾脏发生肾功能不全，肌酐无法正常滤过，进而在机体内蓄积变成毒害机体健康的毒素。同样，球虫还会破坏机体抗氧化体系的平衡，使一些金属酶类如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低，而丙二醛、过氧化氢酶含量升高，加剧了细胞的损伤[18]。当机体中的氧自由基攻击脂质中的不饱和脂肪酸时会产生一种重要的代谢物——丙二醛。丙二醛对细胞具有杀伤作用，对细胞造成严重的伤害。在肾功能不全失代偿时，血尿素氮将升高。在日粮中添加抗氧化剂物质则可提高鸡体的抗氧化能力，降低丙二醛含量，进而改善肠道健康和抗氧化状态，促进球虫感染鸡的生长性能[15]。本研究显示，与感染组相比，灌胃40 mg/kg纳米氧化锌使雏鸡的谷丙转氨酶活性、尿素氮含量显著升高，灌胃10 mg/kg纳米氧化锌使雏鸡的谷草转氨酶活性显著升高，灌胃20、40 mg/kg纳米氧化锌使雏鸡的丙二醛含量显著升高，不同浓度的纳米氧化锌均使雏鸡血清肌酐含量显著降低。研究表明，纳米氧化锌可对感染球虫的雏鸡起到一定的保护作用。图门巴雅尔等[19]发现，雏鸡22日龄时，与健康组相比，未给予药物的球虫攻毒组雏鸡血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶值升高；在日粮中添加常规陆合剂、地克珠利时，ALT和AST活性显著降低。杨金玉[20]研究表明，肉仔鸡球虫感染后，机体的抗氧化能力明显下降；加入葡萄原花青素（GPC）后，肉仔鸡血清丙二醛含量则明显下降，低于感染组，且以GPC浓度7.5、15.0 mg/kg时效果较好。李佩国等[21]发现，柔嫩艾美耳球虫感染引起鸡血清中肌酐含量降低，对肾小管功能造成一定的损伤，添加复方中草药可在一定程度上降低球虫感染对肾脏功能的损伤，对机体起到一定的保护作用。3.5纳米氧化锌对球虫攻毒雏鸡肠道损伤的影响艾美耳球虫孢子化卵囊进入鸡体后，释放出的子孢子主要侵入十二指肠上皮细胞，子孢子、裂殖子、配子体等在肠道上皮细胞中反复大量增殖，导致绒毛上皮细胞变性、坏死，黏膜层萎缩、脱落，使肠黏膜的完整性受到破坏。肠道黏膜受到损伤，黏膜细胞间连接增宽，通透性增加，进而血浆蛋白漏入肠腔、肠道平滑肌收缩蠕动变慢、肠道黏膜损伤[14]。已有研究表明，纳米氧化锌在细胞水平以及动物体内会产生一定的毒理作用，可对动物的脏器造成亚急性损伤，对消化系统的作用分布靶器官主要是肝脏、肾脏和脾脏，高剂量纳米氧化锌会在鸡肠道堆积，堵塞肠道，引起肠炎、肝细胞水肿性坏死等病变[22-24]。纳米氧化锌还会引起动物体内大量产生活性氧，引起体内组织和细胞的系列病变。本试验结果显示，纳米氧化锌可改善被球虫侵害后雏鸡肠道的损伤，对雏鸡肠道具有一定的保护作用。4结论本研究结果表明，纳米氧化锌会抵抗球虫对鸡的感染，高剂量的纳米氧化锌会减弱鸡的体重下降程度，降低鸡粪便中的球虫卵囊数，降低球虫感染而造成的肠道损伤。同时，纳米氧化锌可降低球虫对鸡的感染后相关肝功功能、肾功能的损伤。