淀粉可为动物生长提供能量，但饲料中淀粉颗粒大小、结构、直支比差异均会影响淀粉在动物体内的消化。动物自身的唾液淀粉酶和胰淀粉酶是主要的淀粉水解酶。唾液淀粉酶存在口腔中，饲料在口腔中停留时间短消化作用不明显，当动物处于幼年阶段自身胰淀粉酶水平较低，消化淀粉能力弱。动物饲料中添加淀粉酶可弥补动物内源淀粉酶的不足[1]。α-淀粉酶（α-Amy）是动物饲料中常用的添加剂，作用于淀粉分子的α-1, 4糖苷键[2]。α-Amy主要功能是加速淀粉糖化，提高淀粉糖化率和麦芽糖得率，提高饲料的饲用价值[3-4]。生物界中α-Amy广泛存在于动植物、微生物体内。从生物活性和可获得性来看，微生物来源的α-Amy最具应用潜力，而细菌α-Amy优势更加突出。因此，对细菌α-Amy进行深入研究将提高淀粉利用率，进而改善动物生长。本文从α-Amy的来源、细菌α-Amy结构与催化机制以及活性提升等方面进行综述及展望，为细菌α-Amy的进一步开发应用提供参考。1α-Amy的来源1.1植物α-Amy植物α-Amy来源丰富，薯类、禾谷类、豆类以及植物果实中均已发现α-Amy[5]。丁燕等[6]发现，在盐胁迫处理下α-Amy活力与种子萌发变化趋势一致。高媛等[7]发现，小麦内源α-Amy过高会影响小麦制品品质，成熟种子中残留α-Amy对馒头品质具有显著影响。王永刚等[8]依据植物萌发时具有淀粉酶活性，从马铃薯中克隆了α-Amy基因并异源表达。Hou等[9]研究表明，α-Amy基因StAmy23可调节马铃薯淀粉分解和块茎休眠，StAmy23基因沉默延迟块茎发芽。植物α-Amy多位于植物种子或芽端，且淀粉酶活性存在广泛差异[10]。植物α-Amy的存在不利于植物发育和果实保存，含量不会过高[11]。因此，植物α-Amy不能承担工业生产的需要。1.2动物α-Amy动物α-Amy多存在于动物唾液和胰腺中，由基因amy1和amy2表达。无论是唾液淀粉酶还是胰淀粉酶，最适温度均为40 ℃，低于20 ℃或高于55 ℃会失去催化活性，最适pH值和最适温度范围较窄。目前对动物α-Amy的研究多与疾病诊断、酶分子特性以及基因异源表达相关，用于饲料添加工业方向的很少。2013年，夏新界等[12]发明一种猪胰腺α-Amy的制备方法，通过基因克隆、酵母异源表达、高密度发酵，获得57 kDa的α-Amy。纯化重组酶与天然酶相比，最适温度、最适pH值无明显差异。将动物α-Amy克隆到微生物中异源表达可大大提高酶产量，降低生产成本。1.3真菌α-Amy动植物α-Amy反应条件较苛刻，获取效率低，远远不能满足工业生产的需求。微生物α-Amy可依据不同菌种的生理特性提取纯化出适应各种恶劣复杂环境的α-Amy。其中，真菌α-Amy来源有曲霉属、青霉属、木霉属、根霉属和酵母菌属等[13]。Anigboro等[14]利用少孢根霉对木薯皮进行固态发酵生产α-Amy，纯化酶最适温度为60 ℃，最适pH值为7，Vmax和Km值分别为17.36 U/mL和0.33%。真菌α-Amy生产方式多为固态发酵，周期长、速度慢、工艺控制难、产品提纯复杂。因此，液态发酵逐渐成为生产真菌α-Amy的工艺替代方案。2013年，姜黎黎等[15]利用液态发酵米曲霉，条件控制为每分钟空气体积比料液体积1.5~2.0、溶氧量20%~25%、转速500~1 000 r/min，可获得真菌α-Amy。2015年，李杰等[16]构建一种真菌α-Amy基因工程菌，经液态发酵后发酵液中α-Amy活性达15 368 U/mL。但目前高产α-Amy的真菌菌种仍然紧缺，且工业化生产成本相对高昂，导致真菌α-Amy在饲料工业中的应用并不广泛。1.4细菌α-Amy细菌α-Amy具有耐高温、耐酸、耐碱等特性，适合工业生产中某些极端条件。此外，细菌产酶的优势还具有产量大、易处理、成本低、无季节性等[17]。芽孢杆菌属常用于生产耐热α-Amy，枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、嗜热脂肪地芽孢杆菌（G. stearothermophilus）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）已广泛应用于酶制剂。部分细菌来源α-Amy性质见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.031.T001表1部分细菌来源α-Amy性质菌株最适pH值最适温度/℃酶活力/(U/mL)性质文献来源Thermus filiformis Ork A25.5~6.0952.42耐酸Egas等[18]Bacillus subtilis8.09028.17耐碱、耐高温宋素琴等[19]Raoultella terrigena7.05040.60—赵淑琴等[20]Brevibacillus choshinensis sp34.2~4.695—耐酸、耐高温谢秋宏等[21]Bacillus licheniformis5.580—耐酸、耐高温刘雪莲等[22]Bacillus cereus6.0—60.20—曹丹等[23]Bacillus strain IBT1087.07010.50耐酸Mahato等[24]Bacillus velezensis D18.06020.59耐酸Hu等[25]注：“—”文献未提及。2细菌α-Amy结构与催化机制2.1细菌α-Amy结构地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的晶体结构见图1[26]。由图1可知，α-Amy由3个结构域组成：结构域A最保守，由8个平行β链对称折叠而成，这些β链排列在由8个α螺旋环绕的桶[(β/α)8桶]中；结构域B是结构域A的β3链和α3螺旋之间突出的环；结构域C则是以希腊密钥为特征的C端扩展。参与催化和底物结合的氨基酸残基位于结构域A中央β桶的C端侧，并被突出的结构域B部分从另一侧覆盖[27]。在结构域A和B之间形成开放活性位点裂缝，使结构域B的残基可参与底物结合。底物结合位点通常含有芳香族残基（Phe、Trp和Tyr），与糖环形成疏水堆积作用。结构域A均有1个催化活性必需的Asp-Glu-Asp催化三联体，也是重要的底物结合位点，同时大多数酶还具有两个对稳定过渡态至关重要的His残基。这5个残基出现在整个家族中4个保守短序列中，且这些序列中一些关键氨基酸残基与酶特异性有关[28]。此外，活性位点还有许多直接或通过水分子与底物形成氢键的残基。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.031.F001图1地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的晶体结构在美国国家生物技术信息中心（NCBI）蛋白数据库中搜索α-Amy，相关条目可达百万条。选定细菌来源且结构数据已上传至国际蛋白质结构数据库（PDB），再从中选取6种不同细菌α-Amy，包括高温放线菌（T. vulgaris）、B. licheniformis、G. stearothermophilus、B. subtilis、B. amyloliquefaciens和奥氏嗜热盐丝菌（H. orenii），PDB号分别为1JI1、1OB0、1HVX、1UA7、3BH4、1WZA，利用Pairwise structure Alignment对其氨基酸序列和蛋白三维结构进行比对，结果见图2。由图2可知，虽然不同细菌α-Amy氨基酸序列相似性仅为20%，但均具有相似的三维结构，目标覆盖率达77%。T. vulgaris的α-Amy由N、A、B、C等4个结构域组成，结构域N与A和B发生强烈相互作用，从而为酶提供球形结构，可更有效地水解淀粉[29]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.031.F002图26种细菌α-Amy的三级结构比对结果注：木瓜色：T. vulgaris；蓝色：B. licheniformis；绿色：G. stearothermophilus；粉色：B. subtilis；红色：B. amyloliquefaciens；橙色：H. orenii。除少数外，所有已知α-Amy均含有至少1个保守Ca2+结合位点，位于结构域A和B界面上。蛋白质在无金属离子存在时，通常是部分无序的并不适合晶体学分析，因此关于金属如何通过改变或稳定蛋白质构象调节功能的结构基础的研究相对较少。B. licheniformis的α-Amy（BLA）无金属形式的结构可用，因此可通过这一特性对金属离子调节酶活性方式进行研究。Machius等[30]报告了BLA晶体结构，在所有α-Amy保守的Ca2+结合位点上，形成了前所未有的线性三元金属阵列的一部分，其中两个Ca2+位于中心Na+两侧。与无金属BLA结构相比，包含21个残基的金属三联体周围区域表现出螺旋展开和无序到有序转变的构象变化，会形成延伸的底物结合位点，该研究在结构水平上解释了α-Amy的Ca2+依赖性。此外，位于结构域A和C界面上也有1种Ca2+，之前在其他α-Amy中未观察到，推测这种现象仅存在于耐热细菌α-Amy中。冀旭等[31]发现，Ca2+对三级结构没有直接影响，而是二级结构发生变化。Ca2+激活α-Amy时，二级结构中β-折叠数量明显下降，α-螺旋和β-转角结构明显上升；Ca2+抑制α-Amy时，β-折叠数量上升，α-螺旋和β-转角数量反而下降。研究者可根据这些结构信息合理设计突变位点，构建性能增强的α-Amy突变体。2.2α-Amy催化机制对比细菌α-Amy一级结构发现，氨基酸序列不尽相同，但三级结构具有高度相似性，表示α-Amy的三级结构与其功能密切相关。结构域A与催化有关，结构域B与底物特异性结合有关，结构域C与蛋白质稳定、折叠和底物结合有关。Asp-Glu-Asp催化三联体分别作为亲核试剂、质子供体和过渡态稳定剂，位于(β/α)8桶β4、β5和β7的C端或附近[32]。α-Amy催化机制为双置换机制，见图3。第一次置换时，α-Amy酸性基团使糖苷的氧质子化，导致C1—O键断裂，并短暂形成类似氧碳离子的过渡态[33]。酶的亲核基团攻击糖异头碳，形成糖基-酶中间体，而底物的糖苷配基离开活性位点。第二次置换时，上述过程基本上被一个由前质子供体的羧酸形式激活的水分子所逆转。反应的第二阶段通过类离子过渡态进行，得到具有α-异构的产物[28]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.031.F003图3催化反应的双置换机制[28]3α-Amy活性提升的研究现状3.1诱变处理产酶菌种诱变处理包括紫外诱变法、亚硝基乙基脲法、甲基磺酸乙酯法等，可用于提升α-Amy产量或改变菌种性质。纪亮等[34]采用低真空室温射频等离子体对B. amyloliquefaciens CICC 10035进行预处理，120 W放电功率、135 Pa工作气压，预处理15 s，发酵液α-Amy酶活力大于400 U/mL，相较对照组提高近20%。赵天惠等[35]利用脉冲强光诱变技术处理B. subtilis，获得耐高温、耐酸、耐盐突变株B3和B7，其中α-Amy活性与原始菌株相比提高了67%和77%（P0.01）。但要注意，诱变处理菌种稳定性较差，性质稳定遗传需要经过不断传代并检验[36]。这种方法的菌株变异方向不可控，需建立高通量筛选方案。3.2定向突变α-Amy分子根据酶分子结构及催化机制对α-Amy基因进行定向改造，进而影响酶分子高级结构，有概率获得活性提升的菌株。Gai等[37]对G. stearothermophilus的α-Amy基因利用定点突变构建缺失Arg179和Gly180的缺失突变体AmySΔR179-G180。经测定AmySΔR179-G180热稳定性增强，表现出更大的耐酸性和低钙需求。在7.5 L发酵罐中补料分批发酵，酶活力高达3 300 U/mL，生产率高达45.8 U/(mL·h)。刘文龙等[38]对B. licheniformis CGMCC NO.2062的α-Amy进行结构、分子动力学模拟和热稳定分析后，优化设计突变位点，最终成功筛选出一种酶活力更高的耐酸耐高温α-Amy，发酵酶活力高达282 020 U/mL。但有些酶受限试验技术和样品制备过程，未能获得晶体结构；基于同源建模预测，再利用分子模拟、虚拟氨基酸突变等方法在试验前进行突变位点模拟测试，用以指导理性设计定点突变，大大减少工作量和成本。Liu等[39]通过虚拟突变和定点诱变相组合，分析活性位点区域芳香族残基取代对多功能酶BSGH13的底物亲和力和催化特异性的影响。结果表明，在L182和L183位置引入Phe或Trp，改变了BSGH13向不同底物的局部相互作用网络，从而改变了酶的多功能性。3.3构建基因重组菌株构建重组表达载体时，在目的基因前插入强启动子能够使α-Amy在异源细胞中剧烈表达，α-Amy活性显著提升。李松[40]将组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子GAP和诱导型醇氧化酶启动子AOX1启动子插入到米根霉的α-Amy基因前，成功构建高效表达载体，并在酵母系统中异源表达。结果显示，结合使用GAP和AOX1时酶表达量最高，约为462.8 U/mL。虽然部分细菌用于重组蛋白的分泌表达具有很好的潜力，但其分泌能力尚不足以满足工业生产需要，找寻合适信号肽和其他表达元件将是提升其分泌能力的主要方法。分泌性前体蛋白作为未折叠多肽跨细胞膜转运时，在蛋白释放到培养基之前，I型信号肽酶催化前体蛋白N端信号肽序列的裂解[41]。Tran等[42]采用pSIP表达系统进行植物乳杆菌S21的α-Amy（AmyL）的表达，4种信号肽中Lp_2145具有最佳表达效果，AmyL总酶活和胞外酶活最高（13.1和8.1 U/mL），显著高于天然信号肽表达（6.2倍和5.4倍）。因此，为提高目的蛋白表达量及活性，需要对表达元件进行适当优化，包括更换启动子、筛选信号肽、共表达分子伴侣等[43-44]。3.4优化异源表达宿主及条件菌株常根据表达需求选择合适宿主。大肠杆菌培养周期短、表达量大、遗传背景清晰，但无翻译后修饰；B. subtilis为安全菌株，蛋白分泌能力强，但易形成芽孢；酵母菌生长快、遗传背景清晰易操作、表达量高，但缺乏高效表达元件。若要提高重组蛋白表达量，可优化异源表达宿主及表达条件。Hu等[25]从玉米种子中分离出1种产耐酸α-Amy的维勒岑芽孢杆菌，经基因克隆及大肠杆菌异源表达，纯化重组酶活力为20.59 U/mL，是粗淀粉酶制剂的近7倍。檀瑞婷等[45]将嗜热古菌Pyrococcus furiosus的超高温α-Amy基因克隆并于B. subtilis中成功表达，通过信号肽AspB'和伴侣蛋白PrsA共表达提高酶活力（134.15 U/mL）。Kachan等[46]将弯曲芽孢杆菌α-Amy（AmyM3）在重组菌株B. subtilis168-28中成功表达，并发现在转录水平上葡萄糖抑制AmyM3合成，由分解代谢控制蛋白Ccp介导。2013年，Nathan等[47]为克服碳分解代谢物阻遏（CCR）开发一种自诱导、无CCR、葡萄糖激活的表达系统，用以提高嗜热α-Amy产量。与亲本菌株相比，2%葡萄糖中获得约300倍的高产率（9 070 U/mL），在4%糖蜜中获得100倍的产量（3 080 U/mL）。因此，出现这种情况时，一味寻求高效表达载体无法有效提升酶活力，而降低CCR影响设计新型表达系统成为提升α-Amy活性研究的新方向。Yao等[48]选择缺乏6种胞外酶的B. subtilis WS9作为宿主菌株，又进行热休克蛋白调节基因（hrcA）灭活、共表达运输通道成分SecYEG复合物、信号肽SPRpmG平衡目标蛋白分泌过程，之后与B. stearothermophilus α-Amy（AmySA）进行基因重组，所得重组菌株WHS9GSAB能够有效产生AmySA，摇瓶发酵显示酶活力为2 835.1 U/mL，扩大到3 L发酵罐后显示酶活力为35 779.5 U/mL，是迄今为止报道B. subtilis重组α-Amy产量的最高水平。次年，该团队选择具有低胞外蛋白酶活性且具有较高蛋白质合成及分泌能力的短小芽孢杆菌Brevibacillus choshinensis HPD31作为出发菌株，通过CRISPR/Cas9系统敲除编码胞外蛋白酶基因（bcp），共表达分子伴侣prsQ，最终重组菌株（BCPPSQ）摇瓶发酵产生6 940.9 U/mL的酶活力，扩大到3 L发酵罐后显示17 925.6 U/mL的酶活力[49]。对比两株重组菌株数据，发现摇瓶发酵条件下酶活力高并不意味着扩大生产后酶活力同比升高，而是受到多种因素影响。Allala等[50]从阿尔及利亚热泉中分离到1株微嗜热乙型变形杆菌（Tepidimonas fonticaldi strain HB23），为提高α-Amy产量，对培养基、营养元素等13个因素进行研究，最终确定接种量1%、可溶性淀粉15 g/L、麦麸5 g/L和胰蛋白胨1 g/L为最佳条件，α-Amy酶活力为320 U/mL，相较未优化时增加了10倍。继续对产酶菌株筛选、重组表达策略优化、发酵条件优化等进行深入研究，将会不断提高α-Amy或其他重组蛋白的生产量，保证饲料工业生产的强烈需求。4展望为满足我国日益发展的饲料工业生产需求，需深入了解细菌α-Amy的分子结构与催化机理，合理设计改造方案，通过诱变处理、定向突变、基因重组等技术不断提升新菌种的研发，以获得活性高、抗性强的优良α-Amy。此外，研发重组菌株只是一方面，要实现α-Amy产量及活性提高，还需要保证合成的淀粉酶能分泌到胞外，这是保证α-Amy从实验室到工厂生产的关键步骤。