南美白对虾学名为凡纳滨对虾（Penaeus vannamei），最早于1998年引入我国，因生长速度快、环境适应力强、耐病害等特点得到迅速推广[1]。但在人工养殖过程中，由于养殖规模大、养殖空间狭小、人工饲料品质不一，难免会出现生长缓慢、免疫力低下、发病率高、肉质暗淡粗糙等情况。虾青素是一种酮式类胡萝卜素，常态下为红色固体、粉末状，具有脂溶性，不溶于水。天然虾青素主要来自富含类胡萝卜素的动物、植物以及微生物中，如雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）、红法夫酵母（Phaffia rhodozyma）、南极磷虾（Euphausia superba）中均可提取出天然虾青素[2-4]。侧金盏花（Adonis amurensis Regel et Radde）的花瓣中也含有虾青素等活性成分，可作为提取虾青素的来源[5]。与传统的虾青素提取原材料相比，侧金盏花具有易大规模培养、种植条件简单、产量大、价格低廉等特性。水产养殖中无法大规模投入虾青素的很大一部分原因就是高昂的价格，与高纯度人工合成虾青素和传统红球藻虾青素相比，取自侧金盏花的虾青素粉末成本可减少约一半，其在虾青素产业中的应用前景值得关注[6]。侧金盏花作为虾青素提取的新原材料具有很大的发展潜力，但目前针对侧金盏花相关的虾青素研究较少。本研究在饲料中添加提取自侧金盏花的虾青素开展南美白对虾饲喂试验，测定其对南美白对虾的生长性能、抗氧化能力以及免疫能力等指标的影响，为提取自侧金盏花的虾青素在南美白对虾养殖领域中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用虾青素采用青岛云大地生物科技有限公司生产的洛德斯左旋活力虾青素粉末。试验用基础对虾饲料选自揭阳海大饲料有限公司生产的对虾饲料，其营养水平见表1。将购买的饲料粉碎过筛（60目），与适当比例虾青素粉末混合并称重，加工成直径1.1 mm的颗粒状虾青素对虾饲料，在40 ℃下烘干并避光保存于-20 ℃的冰箱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.009.T001表1基础饲料营养水平项目粗蛋白粗脂肪粗纤维粗灰分总磷赖氨酸钙含量≥37≥7≤3≥16≥1≥1.70.4~2.5%1.2试验设计与饲养管理试验用南美白对虾选取同一批次、平均体长（2.40±0.45）cm、平均体重（1.20±0.18）g一致的健康对虾。试验前进行7 d的集中暂养，暂养期间统一投喂基础对虾饲料。暂养结束后，所有对虾随机分为4组，各组虾分别喂养虾青素含量为0（对照组）、60（试验1组）、90（试验2组）、120 mg/kg（试验3组）的4种饲料，每组3个重复，每个重复40尾虾。试验期30 d。养殖过程中，每两日换水1次，换水量为整体水量的2/3，保持养殖缸内水质环境：水温控制在21~26 ℃、溶解氧大于4.5 mg/kg、pH值保持在7.2±0.2。早晚各投喂1次饲料（8：00、18：00）。日投喂量为虾体重的3%~5%，根据南美白对虾的生长情况调整投喂的饲料量，在投喂前后30 min内使用大型胶头滴管清理鱼缸中的粪便和残饵。1.3测定指标及方法1.3.1生长指标在养殖试验结束后，每个重复随机挑选5尾对虾称重，计算平均增重率、特定增长率、饵料利用率、蛋白质效率、肝体比等指标。平均增重率=[(m1-m0)/m0]×100%(1)特定生长率=[(lnm1-lnm0)/t]×100%(2)饲料利用率=[(m1-m0)/ms]×100%(3)蛋白质效率=[(m1-m0)/(ms-mp)]×100%(4)肝体比=(mx/m1)×100%(5)式中：m0、m1、ms、t、mp、mx分别表示初重、末重、饲料干重量、饲养时间、饲料中粗蛋白含量、肝胰腺质量。1.3.2存活率养殖试验结束后，统计各鱼缸中存活的对虾个体数，计算存活率。存活率=存活量/初始数量×100%(6)1.3.3抗氧化、免疫指标试验结束后，每个重复随机挑选10尾对虾解剖，取出对虾肝胰腺放置离心管中，精确称取肝胰腺质量并迅速放入冰盒中；取样后统一转入-80 ℃的低温冰箱中保存，用于测定超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）。酶活力测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，操作按照试剂盒说明书执行。1.3.4常规营养指标试验结束后，每个重复随机挑选10尾对虾解剖，取肌肉组织置于培养皿中转入-80 ℃的低温冰箱中保存用于测定常规营养指标。水分的测定使用质量作差法（GB/T 5009.3—2016）；粗灰分的测定使用550 ℃下灼烧恒重法（GB/T 5009.4—2016）；粗脂肪含量的测定使用索氏浸提法（Foss Soxtec 8000 索氏提取测定仪，丹麦福斯有限公司，GB/T 5009.6—2016），粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法（Foss Kjeltec Sampler 8420 凯氏定氮仪，丹麦福斯有限公司，GB/T 5009.5—2016）。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 23软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1虾青素对南美白对虾生长性能、肌肉常规营养成分的影响（见表2、表3）由表2可知，与对照组相比，各试验组对虾末重、平均增重率、特定生长率、饲料利用率、蛋白质效率均显著提高（P0.05），试验2组、试验3组存活率显著提高（P0.05）；试验1组对虾末重、平均增重率、饲料利用率、存活率显著低于试验2组、试验3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.009.T002表2虾青素饲料对南美白对虾生长性能的影响项目对照组试验1组试验2组试验3组初重/g2.50±0.112.50±0.132.50±0.082.50±0.11末重/g3.724±0.570c4.426±0.540b5.137±0.130a5.222±0.160a增重率/%48.96±8.75c77.04±11.32b105.48±10.94a108.88±12.06a特定生长率/(%/d)1.328±0.110b1.904±0.080a2.401±0.120a2.456±0.090a饲料利用率/%53.22±4.32c71.73±6.01b81.96±13.87a83.12±11.93a存活率/%67.41±0.13b71.81±0.04b80.31±0.15a81.06±0.06a蛋白质效率/%1.31±0.16c1.44±0.21b1.48±0.09b1.55±0.16a肝体比/%5.61±0.395.79±0.445.77±0.375.69±0.41注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。由表3可知，与对照组相比，各试验组对虾肌肉粗蛋白、粗脂肪含量均显著提高（P0.05）。试验3组对虾肌肉粗蛋白、粗脂肪含量显著高于试验1组和试验2组（P0.05），试验2组对虾肌肉粗脂肪含量显著高于试验1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.009.T003表3虾青素对南美白对虾肌肉常规营养成分的影响组别水分灰分粗蛋白粗脂肪对照组74.13±0.3110.12±0.0275.08±0.14c1.37±0.12d试验1组74.83±0.7510.03±0.0377.39±0.07b1.55±0.05c试验2组74.74±0.379.83±0.0178.38±0.07b1.64±0.09b试验3组74.79±0.309.33±0.0179.63±0.14a1.86±0.08a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2虾青素对南美白对虾抗氧化和免疫指标的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，各试验组对虾T-AOC及AKP活性均显著提高（P0.05）；试验2组、试验3组SOD、CAT活性显著降低（P0.05）；试验1组CAT、ACP活性显著提高（P0.05）；试验3组ACP活性显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.009.T004表4虾青素对南美白对虾抗氧化和免疫指标的影响组别SOD/(U/mg prot)T-AOC/(mmol/g prot)CAT/(U/mg prot)ACP/(U/g prot)AKP/(U/g prot)对照组5.952±0.310a0.114±0.040d3.773±0.970b22.791±1.320b12.662±0.470b试验1组6.422±0.290a0.153±0.040c4.101±0.830a27.894±1.170a14.973±0.630a试验2组4.678±0.190b0.214±0.060b3.387±0.930c24.903±1.090ab16.406±0.630a试验3组5.168±0.180b0.301±0.040a2.895±1.620c16.985±1.070c15.219±0.620a3讨论3.1虾青素对南美白对虾生长性能和肌肉常规营养成分的影响本研究表明，当虾青素添加量在60~120 mg/kg时，南美白对虾的末重、平均增重率、特定生长率均显著提高，表明虾青素具有促进虾类生长发育的作用。温为庚等[7]发现，160 mg/kg虾青素能够显著提高斑节对虾（Penaeus monodon）的增重率以及特定生长率。耿泽星等[8]发现，与人工饲料相比，添加8.25%含有虾青素的藻钩虾粉饲料能够显著促进凡纳滨对虾亲虾的生长和性腺发育，同时对幼虾的抗氧化能力和脂质代谢也具有促进作用。类似研究在其他水产动物中也有报道。吴雪芹等[9]研究表明，虾青素可提高大鳞副泥鳅幼鱼（Paramisgurnus dabryanus）肠道消化酶活性，进而提高饲料转化率和蛋白质效率，最终促进幼鱼生长发育。惠文杰[10]发现，植物源虾青素能够显著提高克氏原螯虾（Procambarus clarkii）生长，并具有明显的增色效应。王照欣等[11]发现，1 574 mg/kg虾青素饲料能够促进南美白对虾生长发育，提高亲虾卵巢卵黄蛋白含量，促进性腺发育。本研究中，添加虾青素的饲料利用率显著高于对照组。王海芳等[12]研究对比不同浓度梯度的虾青素饲料对凡纳滨对虾饲料转化率的变化，发现饲料转化率随着虾青素浓度呈正相关，且虾青素含量为100~150 mg/kg时，饲料转化率最高，比对照组提高了13%，表明添加虾青素具有提高饲料转化率和降低养殖成本的作用。饲料中虾青素添加量不同也会在不同程度上影响对虾的生长情况。本试验中，90、120 mg/kg虾青素组各项生长指标的提升幅度均显著高于60 mg/kg组；同时90 mg/kg和120 mg/kg组的生长指标差异不显著，表明虾青素对生长的影响存在最适浓度，不同物种虾青素促生长的最适浓度各不相同。这一结论在类似的研究中也有所体现[13-15]，如高体鳑鲏（Rhodeus ocellatus）的最适虾青素浓度为150~200 mg/kg，七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciata）在虾青素浓度为50 mg/kg时存在最适生长速率。本试验中，投喂虾青素饲料30 d后，试验组的存活率显著高于对照组。裴素蕊等[16]的试验中，80 mg/kg虾青素显著提高了凡纳滨对虾的生长率，但存活率与对照组无显著差异，与本研究的结果不同。可能是由于本试验养殖对象个体普遍较小，虾青素的作用更明显，这一点也在金征宇等[17]的研究中被证实，虾青素使罗氏沼虾幼虾（Macrobrachium rosenbergii）的存活率提高了21.66%。本试验中，南美白对虾肌肉中水分和灰分无显著差异，对照组南美白对虾的粗蛋白和粗脂肪含量显著低于试验组，表明虾青素有助于促进南美白对虾肌肉的生长发育，提高肌肉中粗蛋白和粗脂肪的含量。李汶恒等[18]研究结果显示，添加南极磷虾粉后南美白对虾体内粗脂肪含量显著提高，且随着南极磷虾粉添加量增加而呈上升趋势，与本试验结果相似。王猛强等[19]研究发现，虾肌肉中粗脂肪含量与饲料中脂肪水平和类胡萝卜素含量相关，可能是虾青素等类胡萝卜素促进机体对饲料中脂肪酸物质的吸收，增加体内粗脂肪的累积。但在一些研究中，虾青素对养殖对象体内的常规营养成分不存在明显影响。比如，朱旺明等[20]研究表明，南极磷虾粉中的虾青素对大口黑鲈肌肉中的水分、灰分、粗蛋白等的含量无显著影响；余小君等[15]研究表明，30 mg/kg虾青素对蟹体内的水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪等常规营养成分均无显著影响。本研究中，3种不同浓度的虾青素均对南美白对虾体内的粗蛋白、粗脂肪的累积具有一定的促进作用。3.2虾青素对南美白对虾抗氧化功能和免疫功能的影响肝胰腺在甲壳动物的免疫、消化、代谢活动中发挥重要功能，还参与抗氧化应激的作用[21]。动物体内抗氧化能力主要与SOD、CAT、ACP、AKP等指标相关。T-AOC也是衡量机体抗氧化能力的指标。水生动物肝胰腺的抗氧化能力是衡量肝胰腺健康水平的重要指标，提高肝胰腺抗氧化能力对水生动物的生长发育起到至关重要的作用[21-22]。SOD与CAT具有类似的功能，SOD通过催化超氧化物自由基生成O2和H2O2，阻止胞内活性氧生成，延缓细胞老化，而CAT则是将SOD的催化产物转化为H2O和O2，以保证胞内稳态平衡[23]。本研究中，60 mg/kg虾青素具有提高对虾SOD、CAT活性的功能。原因可能是南美白对虾在摄食低浓度的虾青素饲料后，虾青素激活了体内抗氧化酶相关基因的表达，提高了SOD和CAT的表达量，从而提高酶活性，与Cheng等[24]研究中低浓度（100 mg/kg）的虾青素可显著提高克氏原螯虾肝脏SOD活性的结果类似。而本试验中，高浓度虾青素饲料使SOD、CAT表现出较低活性，原因可能是南美白对虾摄食高浓度虾青素饲料后，过量的虾青素充当抗氧化剂参与体内的抗氧化过程，清除自由基，在此过程中由于反应底物减少，导致抗氧化酶体系的活性降低[24-25]。60 mg/kg组对虾始终表现出较高的SOD活性。SOD和CAT的活性变化主要表现为低虾青素浓度的促进和高虾青素浓度的抑制作用。原因可能是低浓度虾青素有助于促进相关抗氧化酶蛋白（如GPx4、Nrf2等）的表达，从而提高抗氧化酶活性[26-27]。此外，虾青素的来源也对机体酶活存在不同影响。刘晓慧[1]研究发现，与人工合成虾青素相比，天然虾青素可显著提高南美白对虾体内抗氧化酶活性。T-AOC是器官内所含有的酶类小分子量抗氧化物以及非酶类抗氧化物质的总和，反映了机体的抗氧化能力[28]。本研究中，60~120 mg/kg虾青素饲料组对虾T-AOC均显著高于对照组，且T-AOC变化与虾青素浓度呈正相关，原因可能是虾青素本身作为抗氧化剂存在，使整体的抗氧化能力增加。因为南美白对虾摄食虾青素后在体内累积，使T-AOC逐渐增加。ACP、AKP均是生物体内重要的酶类，在生物体的免疫和代谢反应中具有重要的作用，ACP作为免疫调节的功能酶，在巨噬细胞吞噬和分解异物的过程中具有提高对异物识别能力的作用；AKP具有在碱性条件下催化水解磷酸单酯、转移磷酸基团的能力，是机体解毒过程中的重要特征酶[29-33]。本研究中，60、90 mg/kg虾青素饲料组对虾的ACP活性均高于对照组，而120 mg/kg虾青素饲料组显著低于对照组。推测原因可能是低浓度虾青素对南美白对虾免疫系统的活化作用，与王军辉等[34]对锦鲤（Procambarus clarkii）的研究中ACP变化趋势类似。60、90、120 mg/kg虾青素饲料组的AKP活性均显著高于对照组，与麻楠等[35]对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的AKP活性研究结果类似，但本研究中3个浓度的虾青素饲料组对虾的AKP活性差异不显著。ACP和AKP的活性变化随虾青素添加量增加呈逐渐下降后趋于稳定，原因可能是机体免疫系统的调节作用，虾青素作为类胡萝卜素能够活化免疫细胞发挥生物学功能，还可直接作用于免疫系统催化产生免疫活性物质；同时养殖对象长期摄食虾青素饲料后，对虾青素的适应性提高，且虾体内虾青素累积量增加，过量的虾青素对免疫系统的促进作用降低[36-37]。4结论本研究结果表明，从侧金盏花花瓣中提取的天然虾青素有助于提高南美白对虾生长性能、饲料利用率、成活率，改善了抗氧化、免疫能力。本试验条件下，当虾青素添加量为120 mg/kg时，南美白对虾各项指标的提升效果最好。