小鹅瘟又称鹅细小病毒病，由鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）引起4~20日龄雏鹅的一种急性或亚急性败血症，以发生渗出性肠炎为主要特征，传播快、病死率高。本病最早由方定一于1956年发现，在我国江苏扬州地区流行，并首次报道该病的流行特点和临诊特征[1]。1961年，方定一团队对该病病原进行系统研究，确定该病原是一种和新城疫、鸭病毒性肝炎无关的病毒，建议命名为小鹅瘟病毒[2]。1967年，匈牙利学者Derzsy利用13日龄鹅胚成功分离出小鹅瘟病毒[3]。1973年，Schettler利用鹅胚成纤维细胞也成功分离到该病毒，病毒的理化特性与其他已知的禽类病毒不同，具备细小病毒的特征，建议将该病毒归类为细小病毒[4]。1974年，世界家禽学会（World's Poultry Science Association，WPSA）为纪念Derzsy对小鹅瘟研究所做出的贡献，将该病命名为Derzsy's病[5]。1979年，国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第3次报告将该病毒正式命名为鹅细小病毒[6]。GPV是细小病毒科（Parvoviridae）成员，归属于细小病毒亚科（Parvovirinae）、依赖病毒属（Dependovirus）、雁形目依赖细小病毒1型（Anseriform dependoparvovius 1）[7]。GPV为单股线状DNA病毒，基因组全长约5 kb，编码区依次编码非结构蛋白NS1、NS2和结构蛋白VP1、VP2、VP3[8]，非编码区由回文序列（inverted terminal repeats，ITR）组成位于编码区两侧，依次为5'-ITP-VS1-VS2-VP1-VP2-VP3-ITR-3'。非结构蛋白NS1和NS2，主要是参与病毒的转录与复制[9]；结构蛋白VP1、VP2和VP3共同组成衣壳蛋白。Tullis等[10]报道，VP1蛋白在病毒感染中发挥重要作用，可以引导衣壳蛋白进入细胞核，与宿主细胞受体结合。VP3是衣壳蛋白的主要组成部分，可占衣壳蛋白总量的80%，内含GPV主要抗原决定簇，是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白[11]。ITR为倒置重复序列，位于基因组的两端，头部可以折叠形成U型发夹结构，ITR主要参与病毒复制与组装的过程[12]。本研究对辽宁地区分离的鹅细小病毒进行全基因测序，并与国内外代表毒株进行序列比对分析，为辽宁地区鹅细小病毒的分子流行病学研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料鹅细小病毒由辽宁省锦州市疾病预防控制中心分离保存；病毒基因组DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；2×Taq Master Mix（含染料）购自北京康为世纪生物科技有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收购自南京维诺赞生物科技有限公司；DL2000 DNA Marker、pMD-18T Vector购自宝生物工程有限公司；DH5α感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司。1.2试验方法1.2.1病毒总DNA的提取取200 μL细胞培养物于灭菌1.5 mL离心管中，用病毒基因组DNA提取试剂盒，按照使用说明书从细胞培养物中提取病毒总DNA后，置于-20 ℃保存备用。1.2.2引物的设计与合成根据GenBank中GPV毒株DY16（登录号：MH209633）设计8对引物，对分离的病毒全基因序列进行分段扩增，引物信息详见表1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.T001表1全基因引物序列Tab.1Whole gene primer sequence引物名称产物长度/bp上游引物（5'→3'）下游引物（5'→3'）位置退火温度/℃GPV1212TCATTGGAGGGTTCGTTCGTCGGCTTAACTATTGGGCTGACCGCGCGCAT1~21459.4GPV2570GCATGCGCGCGGTCAGCCCAATATTCGTCCTGGTTGAACTGATT183~75258.3GPV31 486GTCGGAGAGATGGCACTTTCTGTTCATTCGTTCGGACTTTGAACT498~1 98355.5GPV41 130TACCGTTAGAGGAGCGTATGTTTCGTCTTGTACGGCACTACTACCAC1 828~2 95756.1GPV51 080GGAAGCTTACCGACCACTACCCGGTTGCAGGAGGTACTGCCTGT2 869~3 94858.7GPV6768TGGAATTTCAATGAGGTAGACAGCGAACTGGATTTCTGGGTTCCATC3 732~4 49956.2GPV7504TGCAGACCCTCCAGTAGAATACGCATGCGCGCGGTCAGCCCAATAGTTAAGCC4 361~4 86456.2GPV8229ATGCGCGCGGTCAGCCCAATAGTTAAGCCGTCATTGGAGGGTTCGTTCGT4 878~5 10659.41.2.3全基因序列扩增及克隆测序采用PCR方法对全基因序列进行分段扩增。PCR反应体系（30 μL）如下：2×Taq Master Mix 15 μL、ddH2O 10 μL、引物2 μL、模板DNA 3 μL，按照表1中退火温度进行扩增，扩增产物进行胶回收，纯化后产物连接到pMD-18T载体上并转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布含氨苄西林（100 μg/mL）的LB固体培养基上进行筛选，过夜培养12~16 h，挑取单个菌落，经PCR验证为阳性，使用质粒小提试剂盒提取质粒，放于-20 ℃保存，将所提阳性质粒送至上海生工生物科技有限公司进行测序，每个样品重复扩增及克隆测序3次。1.2.4全基因序列比对分析（见表2）测序结果经NCBI-BLAST比对正确后，采用DNAMAN进行各段序列拼接，获得完整的全基因序列。采用MEGA 7.0、DNAStar 7.0将辽宁分离株鹅细小病毒全基因序列与GenBank中公布的国内外代表毒株进行序列比对分析，并制作进化树。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.T002表2全基因比对代表毒株信息Tab.2Full gene comparison representative strain information毒株宿主来源地区GenBank登录号毒株宿主地区GenBank登录号B鹅匈牙利U25749HB-2019鹅河北MT010852RC16鹅重庆KY475562SH鹅上海JF333590DY16鹅安徽MH209633FJ01鹅福建KT232256LH鹅江苏KM272560SQ0412鹅山东MF942876E鹅安徽KC184133.SYG61v鹅江苏KC99672906-0329鹅台湾EU583391GDaGPV鹅福建HQ89182582-0321鹅台湾EU583390GPV-98E鹅黑龙江KT598506FM番鸭匈牙利U22967Y鹅安徽KC178571YL08番鸭黑龙江MG932366PT番鸭福建KY511293MDPV-GX5番鸭广西KM093740SAAS-SHNH番鸭上海KC1719362结果与分析2.1GPV辽宁分离株全基因各片段PCR扩增结果（见图1）由图1可知，利用PCR方法，成功扩增出GPV辽宁分离株全基因各片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段与预期片段大小基本一致。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.F001图1GPV辽宁分离株全基因各片段PCR产物Fig.1PCR products of all gene fragments of GPV Liaoning isolate注 ： M1、M2为DL2000 DNA Marker；1~8为各片段PCR产物。2.2GPV辽宁地区分离株全基因序列拼接与分析（见表3）采用DNAMAN软件，将测序结果进行拼接、校正，经BLAST验证获得GPV辽宁分离株全基因序列，命名为LNGPV20。分离毒株基因全长5 106 bp，共有两个非结构蛋白NS1、NS2和3个结构蛋白VP1、VP2、VP3，ITR序列长为444 bp。由表3可知，LNGPV20毒株各段基因序列长度与欧洲标准株B毒株各段基因序列长度一致，LNGPV20毒株的结构蛋白与非结构蛋白序列长度与DY16、RC16、HB-2019、SYG61v毒株相同，与82-0321、SQ0412、E、FJ01毒株各蛋白序列长度均存在一定差异。其中ITR基因序列长度变化最大，序列长度在414~447 bp之间，相差33个碱基。14个毒株各段基因序列同源性为91.13%~98.00%，各基因片段核苷酸同源性较高，其中非结构蛋白NS1核苷酸同源性为98.00%，同源性最高。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.T003表3LNGPV20毒株与代表毒株各段基因序列比对Tab.3Alignment of gene sequences between LNGPV20 strain and representative strain毒株ITRNS1NS2VP1VP2VP3DY164141 8841 3722 1991 7641 605RC164141 8841 3722 1991 7641 605HB-20194141 8841 3722 1991 7641 605SYG61v4421 8841 3722 1991 7641 60582-03214161 8861 3722 2021 7671 608SQ04124171 8861 3742 2011 7651 607E4471 8871 3762 2021 7671 605FJ014471 8871 3752 2021 7671 60506-03294181 8861 3722 2001 7651 606GDaGPV4441 8841 3722 2001 7651 606GPV-98E4441 8841 3722 2001 7651 606SH4441 8841 3722 2001 7651 606B4441 8841 3722 1991 7641 605LNGPV204441 8841 3722 1991 7641 605碱基长度414~4471 884~1 8871372~13752 199~2 2021 764~1 7671 605~1 608同源性/%91.1398.0097.8497.7897.6497.80注 ：同源性是采用DNAMEN软件比对分析各毒株片段核苷酸同源性。2.3基于ITR序列比对分析（见图2）由图2可知，GPV全基因组5'端与3'端ITR序列相同，呈末端倒置重复序列。LNGPV20毒株ITR由444个碱基组成，与标准毒株B株相比ITR的5'端缺少一个碱基C，ITR外侧405个碱基形成一个U型的发夹结构，由181个碱基对形成的“茎部”和43个碱基形成的“泡区”构成，“泡区”197~202阴影区为SphⅠ内切酶的酶切位点。ITR内侧有39个碱基，不参与U型发夹结构的形成，但全基因组5'端与3'端ITR内侧的39个碱基呈反向互补，不影响基因组形成回文结构。LNGPV20毒株与B毒株相比，在181个碱基对区域存在20个碱基的差异，但不影响互补配对。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.F002图2LNGPV20毒株5'端ITR序列和二级结构Fig.25'ITR sequence and secondary structure of LNGPV20 strain注 ： 加粗下划线所对应的碱基为LNGPV20株与B株存在差异的碱基；虚线区域为U型发夹结构的“茎部”。2.4LNGPV20毒株全基因序列比对分析（见图3）由图3可知，采用DNAstar软件Jotun Hein方法对LNGPV20毒株与已公布于GenBank 的14个代表毒株进行基因序列的同源性分析，LNGPV20毒株与14个毒株全基因序列同源性在93.2%~98.9%之间，同源性均在90%以上。由此可见，鹅细小病毒全基因序列变化差异不大，比较保守。LNGPV20毒株与DY16、RC16毒株同源性最高，均为98.9%；与标准毒株B株同源性为96.6%，而与GDaGPV、GPV-98E、SYG61v疫苗毒株同源性较低，分别为93.2%、93.4%、93.5%。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.F003图3LNGPV20毒株核苷酸比对分析Fig.3Nucleotide comparison analysis of LNGPV20 strain2.5基于全基因序列的系统进化分析（见图4）由图4可知，采用MEGA7.0软件，根据LNGPV20毒株与已公布于GenBank的20个参考毒株基因序列，构建系统进化树。进化树显示鹅细小病毒的分离株与番鸭细小病毒的分离株分别处于两大遗传分支上，鹅细小病毒的疫苗株与野毒株亲缘关系较远，处于两个小分支内。LNGPV20毒株与DY16、RC16、HB-2019、SQ0412毒株亲缘关系较近，与标准毒株B株亲缘关系较远处于不同分支内。由此可见，国内流行的鹅细小病毒基因组变异不明显，同源性较高，亲缘关系较近。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2021.04.010.F004图420株GPV全基因进化树Fig.420 GPV whole gene evolutionary trees3讨论在细小病毒科所有成员中，GPV、MDPV与人细小病毒AAV-2亲缘关系最近。但AAV-2只有与腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒共同感染时，才能进行病毒复制[11]。而GPV和MDPV不需要辅助病毒，主要通过内吞途径将衣壳蛋白带入细胞，进入细胞质，将病毒DNA转运到细胞核中，进行DNA复制[13]。GPV的基因组比MDPV的基因组短，GPV的ITR在414~447之间，MDPV的ITR在421~457之间。由此可知，GPV、MDPV的ITR长度差异较大[14]。LNGPV20毒株基因组全长5 106 bp，ITR序列长444 bp，ITR内侧有39个碱基不参与ITR的U型发夹结构的形成，而B株ITR内侧有38个碱基不参与ITR的U型发夹结构形成，可能与LNGPV20毒株ITR的5'端缺少一个碱基C有关。有研究表明，ITR的长度，是影响毒株毒力的关键[15]，但宋娜[16]对2株江苏省鹅细小病毒分离株，ITR分别为416 bp和444 bp，且毒力均较强，因此推断GPV的毒力强弱并不能依据ITR的长度来判断。各毒株结构蛋白与非结构蛋白同源性在97.64%~98.00%之间，相对于ITR差异不大。近年来，学者对GPV非结构蛋白与结构蛋白抗原表位区进行定位分析[17]，经郭鹭等[18]、黎明等[19]对GPV结构蛋白、非结构蛋白进行抗原表位的精准定位，抗原表位为VP3蛋白430~435 aa和643~647 aa、NS1蛋白503~509 aa，为疫苗制备、特异性抗体制备等奠定理论基础。辽宁分离毒株与14个毒株全基因序列同源性比对分析，与GDaGPV、GPV-98E、SYG61v疫苗毒同源性均在93%以上，除去ITR序列，疫苗株与国内11个野毒株的NS、NP蛋白同源性均在97%以上，由于疫苗株与野毒株NS、NP同源性较高，且大部分抗原决定簇集中分布于NS、NP蛋白[20]，可见国内小鹅瘟疫苗对小鹅瘟应有较高的保护率，但由于养鹅业饲养环境的差异，导致母源抗体参差不齐，大多数种鹅未进行免疫接种且呈隐性感染，虽然无发病症状，但仍可以散播病毒，导致小鹅瘟对养殖业的危害越来越严重[21]。另外，辽宁分离株与国内野毒株同源性在96.6%~98.9%之间，其中有4个病毒株同源性在98%以上，分别源于安徽、重庆、河北、山东。由此可见，国内流行的鹅细小病毒基因组变异不明显，同源性较高，可能是近年来养鹅业迅速发展，鹅苗流通增加，交叉感染所致。4结论本研究采用PCR方法对鹅细小病毒全基因分段进行扩增，首次获得辽宁分离株全基因序列，该研究结果进一步丰富我国鹅细小病毒基因数据库，同时也为辽宁省鹅细小病毒的防控提供参考。