机体在生命代谢过程中伴随氧化还原反应[1]。动物在各种应激因素影响下易发生氧化应激[2]，进而发生代谢异常、生长发育受到抑制以及抗病能力下降等情况[3]。有研究发现，补充抗氧化剂可提高机体的抗氧化能力和降低代谢疾病的发病率[4]。但张献忠等[5]发现，人工合成抗氧化剂会对机体产生负面毒性作用。因此，开发天然、无毒性的抗氧化剂是当前研究的热点[6]。黑沙蒿（Artemisia annua）是多年生菊科蒿属草本植物[7]，性味辛苦微温，具有祛风湿的功效[8]，是常用的中医、蒙医药材之一[9]。黑沙蒿生物活性成分包括醇类、酚类、有机酸、糖类和萜类等物质[10]，主要活性成分是黄酮类和萜类化合物[11]，能够抑制自由基和活性氧（ROS）。黑沙蒿具有一定抗氧化特性[12]，能够降低动物发病率，促进动物生长[13]。杜海东等[1]发现，不同生长时期的黑沙蒿水提物（AOE）抗氧化活性显著差异，7月最高，8月次之。张生楠等[6]发现，5月、6月采收的黄花蒿多糖抗氧化活性显著低于7月。杨硕等[14]发现，8月采收的艾蒿水提物的体外抗氧化能力最强。关于不同刈割时期和存储时期下AOE抗氧化活性差异规律尚不明确，本研究以不同时期（7月、8月、9月、10月）刈割的黑沙蒿为原料制备AOE，研究不同储存时间（新鲜制备、储存1个月、储存2个月、储存3个月）AOE的抗氧化活性，探究不同刈割时期和储存时间对AOE抗氧化活性的影响规律，为进一步合理利用黑沙蒿资源提供参考。1材料与方法1.1试验材料和试验设计黑沙蒿采自内蒙古自治区鄂尔多斯境内。将采集的黑沙蒿在室温下阴干后切成小段，称取50 g，按照料液比1∶20 g/mL加入蒸馏水（每组3个重复）。将样品在70 ℃恒温水浴1.5 h，过滤，按照料液比1∶16 g/mL加入蒸馏水，70 ℃恒温水浴1 h，过滤，将两次滤液合并，浓缩，冻干制成干粉，即为本试验所用的AOE。采用单因素随机试验设计，按不同刈割时间分4组，分别为7、8、9、10月；按不同存储时间分4组，分别为新鲜制备、储存1个月、储存2个月、储存3个月（7月刈割）。配制不同水平AOE稀释液。抗氧化能力以VC为对照。1.2测定指标及方法1.2.1Fe3+还原力选择10.0、12.5、20.0、25.0、40.0、50.0 mg/L的AOE稀释液，参考袁博等[15]方法测定AOE的Fe3+还原力，紫外分光光度计于波长700 nm处测吸光度值。1.2.2DPPH自由基清除率选择6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L的AOE稀释液，根据毛文岳等[16]方法测定AOE对DPPH自由基的清除能力，紫外分光光度计于波长517 nm处测定吸光度值，计算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%(1)式中：Ax为加入样液后DPPH混合液吸光度；Ax0为本底吸光度；A0为未加样液的DPPH吸光度。1.2.3羟基自由基清除能力选择50、100、125、150、175、200 mg/L的AOE稀释液，根据涂宗财等[17]方法测定AOE对羟基自由基的清除能力，紫外分光光度计于波长510 nm处测定吸光度值，计算羟基自由基清除率。羟基自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%(2)式中：A0为空白对照液的吸光度；Ai为加入样品后的吸光度；Aj为样品溶液的本底吸光度。1.3数据统计与分析试验数据采用SAS 8.2软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和SEM表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同刈割时间制备的AOE对体外抗氧化能力的影响2.1.1不同刈割时间制备的AOE对Fe3+还原力的影响（见表1）由表1可知，AOE质量浓度在10.00 mg/L时，7、8月刈割制备的AOE对Fe3+的还原力显著高于10月（P0.05）；AOE质量浓度为12.50~20.00 mg/L时，7、8、9月刈割制备的AOE对Fe3+的还原力均显著高于10月（P0.05）；AOE质量浓度在25.00~50.00 mg/L时，7月刈割制备的AOE对Fe3+的还原力显著高于10月（P0.05）。样品质量浓度在25.00 mg/L时，与VC相比，8~10月刈割制备的AOE均显著降低（P0.05）。样品质量浓度在40.00 mg/L以上时，与VC相比，7~10月刈割制备的AOE对Fe3+的还原力均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T001表1不同刈割时间制备的AOE对Fe3+还原力的影响项目样品质量浓度/(mg/L)10.0012.5020.0025.0040.0050.00VC0.090b0.094b0.091b0.182a0.238a0.278a7月0.128a0.137a0.165a0.169ab0.195b0.192b8月0.139a0.136a0.159a0.159bc0.156bc0.175bc9月0.118ab0.134a0.143a0.143bc0.133bc0.154bc10月0.094b0.102b0.129b0.129c0.120c0.131cSEM0.0100.0100.0120.0050.0220.018P值0.0290.0330.0100.0200.0210.002注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.2不同刈割时间制备的AOE对DPPH自由基清除率的影响（见表2）由表2可知，AOE质量浓度为6.25、12.50 mg/L时，7、8月刈割制备的AOE对DPPH自由基清除率显著高于9、10月（P0.05），7月显著高于8月（P0.05）；AOE质量浓度为25.00、100.00、150.00 mg/L时，7月刈割制备的AOE对DPPH自由基清除率显著高于9、10月（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T002表2不同刈割时间制备的AOE对DPPH自由基清除率的影响项目样品质量浓度/(mg/L)6.2512.5025.0050.00100.00150.00VC40.51a45.17a62.27a93.68a92.20a93.82a7月34.94a43.55a56.53ab67.99b81.73ab82.17ab8月16.95b34.08b46.74bc57.34bc65.06bc69.58bc9月10.28c22.15c42.51c52.18c59.86c64.55c10月9.15c20.82c37.44c47.48c55.07c62.06cSEM0.020.030.040.060.060.05P值0.0100.0010.0110.0020.0120.012%2.1.3不同刈割时间制备的AOE羟基自由基清除率的影响（见表3）由表3可知，AOE质量浓度为50 mg/L时，7、8、9月刈割制备的AOE对羟基自由基清除率显著高于VC（P0.05）；AOE质量浓度为125 mg/L时，7、8、9月刈割制备的AOE对羟基自由基清除率显著低于VC（P0.05）；在AOE质量浓度为100、150、175、200 mg/L时，7月刈割制备的AOE对羟基自由基清除率显著高于10月（P0.05）；AOE质量浓度为175、200 mg/L时，8月刈割制备的AOE对羟基自由基清除率显著高于10月（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T003表3不同刈割时间制备的AOE羟基自由基清除率的影响项目样品质量浓度/(mg/L)50100125150175200VC11.53b26.38a36.84a38.60a46.57a51.35a7月23.51a25.99ab27.15b37.48a44.13ab46.06ab8月22.82a24.26bc26.83b32.77ab44.25ab44.29ab9月21.70a24.61bc24.46b31.48ab32.64bc37.56bc10月20.60a23.33c20.65b25.63b25.32c27.64cSEM0.040.010.030.020.040.04P值0.0430.0300.0130.0180.0110.016%2.2不同储存时间对AOE体外抗氧化能力的影响2.2.1不同储存时间的AOE对Fe3+还原力的影响（见表4）由表4可知，AOE质量浓度为20.0 mg/L时，新鲜制备、储存1个月的AOE对Fe3+还原力显著高于VC（P0.05）；AOE质量浓度为25.0~50.0 mg/L时，各储存时间的AOE对Fe3+的还原力均显著低于VC（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T004表4不同储存时间的AOE对Fe3+的还原力的影响项目样品质量浓度/(mg/L)10.012.520.025.040.050.0VC0.090a0.094a0.091b0.182a0.238a0.278a新鲜制备0.101a0.109a0.122a0.124b0.142b0.156b存储1个月0.101a0.108a0.113a0.118b0.128b0.141b存储2个月0.102a0.107a0.109ab0.110b0.129b0.134b存储3个月0.100a0.103a0.109ab0.110b0.122b0.132bSEM0.0160.0170.0060.0130.0230.021P值0.9790.9640.0320.0140.0260.0032.2.2不同储存时间的AOE对DPPH自由基清除率的影响（见表5）由表5可知，AOE质量浓度为6.25~25.00 mg/L时，各储存时间的AOE对DPPH自由基清除率均显著低于VC（P0.05）；AOE质量浓度为50.00~150.00 mg/L时，新鲜制备的AOE对DPPH自由基清除率显著高于储存3个月的AOE，但显著低于VC（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T005表5不同储存时间的AOE对DPPH自由基清除率的影响项目样品质量浓度/(mg/L)6.2512.5025.0050.00100.00150.00VC40.45a47.05a62.27a93.68a92.20a93.87a新鲜制备15.21b19.43b21.66b40.05b63.31b74.68b存储1个月14.03b19.06b21.98b30.67bc58.24bc65.86bc存储2个月13.92b17.60b20.88b24.54bc50.67bc61.05bc存储3个月10.09b9.68b10.44b14.72c28.42c55.98cSEM0.050.060.060.060.100.05P值0.0160.0160.0150.010.0150.01%2.2.3不同储存时间的AOE对羟基自由基清除率的影响（见表6）由表6可知，AOE质量浓度为175、200 mg/L时，新鲜制备、储存1个月的AOE对羟基自由基清除率显著高于储存3个月（P0.05）；AOE质量浓度为100 mg/L时，新鲜制备的AOE对羟基自由基的清除率显著高于储存3个月（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.014.T006表6不同储存时间的AOE对羟基自由基清除率的影响项目样品质量浓度/(mg/L)50100125150175200VC11.53b26.37a36.82a38.58a46.54a51.33a新鲜制备17.13a24.94ab30.87ab32.24ab34.54b35.06b存储1个月15.64a23.13bc28.02b32.51ab32.12b34.90b存储2个月14.40ab22.67bc25.52b26.84b28.47bc32.26bc存储3个月14.15ab21.87c24.70b26.32b26.40c28.54cSEM0.010.010.020.020.020.02P值0.0240.0290.0150.0230.0010.01%3讨论活性氧（ROS）在生命代谢中发挥重要功能，但其含量过多会使细胞和组织功能障碍，进而造成机体氧化应激[18]。在生产中，通常添加外源抗氧化剂增强机体的抗氧化能力[19]。抗氧化剂能直接或间接减少自由基[20]。其中，植物提取物抗氧化剂可以通过清除自由基[21]、抑制酶促氧化发挥作用[22]。植物提取物的活性成分进入机体后，可以通过上调或下调某基因的表达来诱导相应蛋白的表达，调控信号通路，增强抗氧化能力[23]。金立志等[24]研究发现，植物提取物可以通过改善机体抗氧化酶活性，提高动物养分表观消化率和生长性能。本试验中，各月份的AOE均展现出抗氧化活性，并且随着浓度增加，其抗氧化活性也逐渐升高，与杜海东等[1]的试验结果一致。3.1不同刈割时间和储存时间制备的AOE对DPPH自由基清除率的影响DPPH自由基是1种以氮为中心较稳定的自由基[25]，样品对DPPH自由基的清除能力能够反映抗氧化活性。本试验发现，不同刈割时期的AOE对DPPH自由基的清除能力显示剂量依赖升高效应。AOE质量浓度为150 mg/L时，7月刈割制备的AOE对DPPH自由基的清除率最高，与肖嵋方等[26]结果类似。在储存时间方面，新鲜的AOE对DPPH自由基的清除活性最高。杨雪梅等[27]在测定普洱生茶水提物清除DPPH自由基能力时也发现，随着储存时间的增长，其清除能力也逐渐下降。3.2不同刈割时间和储存时间的AOE对羟基自由基清除率的影响羟基自由基目前所知活性氧自由基中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，可以损伤核生物大分子，导致组织产生氧化损伤[28]。抗氧化剂可通过传递电子和质子给羟基自由基，达到清除自由基目的[29]。本试验中，各月的AOE均对羟基自由基有清除能力，7月最高，8月次之，9、10月相较前几个月明显下降。随着AOE浓度增加，不同时间刈割制备的AOE和不同存储时间的AOE对羟基自由基的清除率均逐渐提高。杨艾华等[30]在湄潭白茶多糖对羟基自由基的清除率试验中也有相似规律发现。AOE富含多糖类[31]、黄酮类[32]等多种抗氧化活性物质。曾涵芳等[33]、陈雪等[34]研究表明，多糖类化合物具有明显的抗氧化作用可直接清除自由基。黄酮类化合物的抗氧化能力与其苯环上的3', 4'-邻二羟基结构有关[35]。AOE的黄酮类活性成分具有该结构[36]，因而具有较强的清除自由基能力。3.3不同刈割时间和储存时间制备的AOE对Fe3+还原力的影响外源抗氧化剂能够提供电子与自由基反应，使自由基反应链中断，脂质过氧化产物的生成被阻断[37]。本试验表明，7月刈割制备的AOE对Fe3+还原能力最强，新鲜制备AOE对Fe3+还原力最高，原因可能是随着储存时间变长，其内部抗氧化活性物质会相应损失[14]。因此，实际生产中应在7、8月刈割黑沙蒿，制备的AOE储存时间以1个月内为宜。4结论不同刈割时间制备的AOE均可表现出体外抗氧化活性，以7月刈割的AOE对DPPH自由基、羟基自由基清除能力和Fe3+还原力最强，8月次之；AOE的抗氧化活性随着储存时间延长而逐渐降低，储存1个月内降低较小。