玉米在我国种植范围广泛，但对玉米须相关产品的开发较少。玉米须是我国传统的中草药[1]。近年来，玉米须的药用价值和经济价值逐渐成为研究热点。黄酮类化合物是玉米须中的功能性成分之一[2]。黄酮类化合物具有抗氧化、降糖、抑菌、抗肿瘤、抗结石等药理作用[3-5]。在畜牧业中，动物的胃肠道健康已成为制约畜牧业发展的重点问题。抗生素治疗动物胃肠道疾病存在耐药性和药物残留等问题，严重威胁了畜牧业的健康发展[6-7]。黄酮类化合物具有维持肠道屏障的作用，能够改善动物肠道炎症，调节肠道菌群，促进肠道消化吸收。田何芳等[8]研究发现，在蛋鸡饲粮中添加植物源黄酮类化合物可以改善蛋鸡的产蛋性能和机体健康，提高蛋壳品质，增强机体抗氧化能力。杨保田等[9]研究发现，在萨能种公羊饲养过程中添加大豆异黄酮化合物有助于提高其生长性能以及免疫功能。Windisch等[10]研究发现，沙棘中的黄酮类化合物能够提高反刍动物的生长性能，有效调节肠道菌群结构。郭元印等[11]研究发现，野山杏总黄酮能够影响三黄肉鸡皮下脂肪，改善屠宰性能。离子液体（ionic liquid，IL）是一类特殊的熔融盐，毒性和腐蚀性较低，溶解及萃取能力较好，可破坏植物细胞壁，便于重复利用[12]，可与水或有机溶剂以任意比例混溶，对微波具有较强的吸收能力[13]。因此，本研究采用离子液体-微波协同提取玉米须中的总黄酮，具有环境友好、溶剂可回收等优点，可为玉米须总黄酮在畜禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试剂玉米须购自奥祥堂保健食品有限公司，芦丁购自国药试剂有限公司，纯度≥98%，[Bmim]Br（溴化-1-丁基-3-甲基咪唑）、1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），分析纯，购自美国Sigma公司。1.2仪器XH-200A微波固液相合成萃取工作站购自北京祥鹄科技发展有限公司，GZF-6150真空干燥箱购自上海目尼实验设备有限公司，FW100万能粉碎机购自江苏飞翔制药设备有限公司，EU-2600A紫外分光光度计购自上海昂拉仪器有限公司，TGl-16C高速离心机购自常州润华电器有限公司。1.3试验方法1.3.1总黄酮的提取方法将玉米须置于60 ℃真空干燥箱中烘干，粉碎，过60目筛。称取10.0 g玉米须，在一定试验条件下置于微波催化合成萃取仪内提取，结束后将样品离心，取上清液备用，置于50 mL容量瓶内定容，得样品溶液。1.3.2标准曲线参考文献[14]的方法，配制4 g/L的芦丁标准溶液，按照不同质量浓度梯度依次配制（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L）标准溶液，置于510 nm测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y=1.461 1x-0.006 4（R2=0.998 7）。1.3.3总黄酮含量吸取样品溶液1 mL，至10 mL容量瓶，定容，摇匀，再吸取1 mL，按照1.3.2方法测定并计算样品中总黄酮含量。提取量(mg/g)=提取液中总黄酮提取量玉米须质量 (1)1.3.4单因素试验设计以玉米须总黄酮提取量为评价指标，设计单因素试验。单因素试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T001表1单因素试验因素及水平水平A微波功率/WB离子液体浓度/(mol/L)C液料比/(mL/g)D提取时间/min12000.2101023000.4202024000.6303045000.8404056001.050501.3.5响应面试验设计[15]为改进玉米须总黄酮提取工艺的参数，基于单因素试验结果，设计四因素三水平响应面试验。响应面试验因素和水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T002表2响应面试验因素和水平设计水平A微波功率/WB离子液体浓度/(mol/L)C液料比/(mL/g)D提取时间/min12000.4202023000.6303034000.840401.3.6不同提取方法试验微波-离子液体提取法：称取1.0 g玉米须粉末，加入0.65 mol/L离子液体25 mL，置于微波催化合成萃取仪内，在45 °C、450 W的功率下提取30 min，结束后冷却至室温，离心得上清液，用离子液体将上清液在50 mL的容量瓶内定容，摇匀，测定吸光度。离子液体加热回流提取法：称取1.0 g玉米须粉末，加入0.60 mol/L离子液体25 mL，于45 °C加热回流提取30 min，结束后冷却至室温，离心得上清液，采用离子液体将上清液在50 mL的容量瓶内定容，摇匀，测定吸光度。乙醇回流加热提取法：称取1.0 g玉米须粉，加入25 mL 75%乙醇溶液，于45°C加热回流提取30 min，结束后冷却至室温，离心，取上清液，采用75%乙醇溶液将上清液在50 mL的容量瓶内定容，摇匀，测定吸光度。1.4抗氧化性能测定1.4.1羟基自由基清除率参考文献[16]的方法，试验组移取不同浓度的样品溶液1.0 mL于10 mL具塞比色管，分别加入0.006 mol/L硫酸亚铁和0.006 mol/L H2O2溶液各1.0 mL，摇匀，静置10 min。加入0.006 mol/L水杨酸溶液1.0 mL，37 ℃水浴加热30 min，510 nm处测定吸光度Am。依法测出对照组（试验组中1.0 mL水杨酸溶液用1.0 mL超纯水取代）吸光度An、空白组（试验组中1.0 mL总黄酮溶液用1.0 mL超纯水取代）吸光度Ak。配制与上述质量浓度相同的VC溶液做对照，测定清除率。羟基自由基清除率=1-(Am-An) Ak×100% (2)1.4.2DPPH自由基清除率参考文献[17]的方法，试验组移取不同浓度的样品溶液2.0 mL于10 mL具塞比色管，加入0.000 2 mol/L DPPH溶液2.0 mL，定容，避光静置30 min，517 nm处测吸光度Am。依法测定对照组（试验组中2.0 mL DPPH溶液用2.0 mL无水乙醇取代）吸光度An、空白组（试验组中2.0 mL各浓度总黄酮溶液用2.0 mL无水乙醇取代）吸光度Ak。配制与上述质量分数相同的VC溶液做对照，测定清除率。DPPH自由基清除率=1-(Am-An) Ak×100% (3)1.5数据统计与分析利用Design-Expert 8.0、Origin 2019和SPSS 19.0软件进行数据处理分析。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1微波功率对总黄酮提取量的影响（见图1）由图1可知，功率从300 W增至400 W时，总黄酮提取量明显增加，继续增加微波功率，提取量开始下降。可能是微波功率增大，对细胞的破壁作用加强，总黄酮的释放增多；但微波功率过高会破坏黄酮的化学结构，提取温度增高的同时，也提高了溶剂体系的黏稠度，导致滤过率低[18]，因此提取量降低。因此，微波功率选择400 W。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F001图1微波功率对总黄酮提取量的影响2.1.2离子液体浓度对总黄酮提取量的影响（见图2）由图2可知，随着离子液体浓度的增加，总黄酮提取量不断增大，在0.6 mol/L时达到最大值，随后开始下降。可能是溶液浓度增加，离子液体的黏度也随着增大，溶剂的扩散能力变小，难以进入植物细胞[19]，影响黄酮的溶出和冷冻离心的分离效果，提取量显著降低。因此，离子液体浓度选择0.6 mol/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F002图2离子液体浓度对总黄酮提取量的影响2.1.3提取时间对总黄酮提取量的影响（见图3）由图3可知，提取时间为30 min时，总黄酮提取量最高，继续提取，提取量开始下降[20]。可能在一定时间内，微波时间延长，细胞所吸收微波能量增多，促进黄酮类物质溶出增加，但微波时间过长，使有效成分在微波条件下发生部分氧化或分解。因此，微波时间选择30 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F003图3提取时间对总黄酮提取量的影响2.1.4液料比对总黄酮提取量的影响（见图4）由图4可知，总黄酮提取量在液料比为30 mL/g时达到最大值，但液料比继续增加，总黄酮提取量反而下降。可能是较多的溶剂会增大其对微波能量的吸收，导致玉米须对微波能量的吸收相应减少，影响总黄酮的溶出，有效成分析出减少[21]。因此，液料比选择30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F004图4液料比对总黄酮提取量的影响2.2响应面试验结果响应面试验结果见表3。响应面试验方差分析见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T003表3响应面试验结果试验号ABCDY提取量/（mg/g）100114.362-1-1004.553-11004.684-10-104.09500005.146010-14.6170-1-104.4680-1104.51900005.1210-100-14.4311001-14.581210014.25130-10-14.72141-1004.49续表3　响应面试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T005表4响应面试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型3.180140.23097.560.000 1A0.06210.06226.450.000 1B0.01310.0135.440.035 1C0.40010.400169.930.000 1D0.06310.06327.060.000 1AB5.625×10-315.625×10-32.410.142 6AC0.03210.03213.900.002 2AD6.250×10-416.250×10-40.270.612 6BC0.15010.15063.600.000 1BD0.04610.04619.830.000 5CD1.225×10-311.225×10-30.530.480 4A21.13011.130486.870.000 1B20.14010.14062.200.000 1C21.33011.330571.770.000 1D20.84010.840389.700.000 1残差0.033142.331×10-3失拟项0.025102.531×10-35.630.404 3纯误差7.320×10-341.830×10-3总变异3.2228注：P0.01表示影响极显著，P0.05表示影响显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T004试验号ABCDY提取量/（mg/g）1511004.461600005.111700005.031800005.121900-1-14.222001014.682110104.2022-10014.312310-104.0624-10104.592500-104.062601104.952701-104.11280-1014.3529100-14.32对表3中数据进行二次多元回归分析，得到回归拟合方程：Y=5.10-0.072A+0.033B+0.18C-0.073D-0.038AB-0.090AC+0.012AD+0.19BC+0.11BD-0.018CD-0.42A2-0.15B2-0.45C2-0.36D2。由表4可知，模型P0.000 1，表明模型效果极显著；失拟项P0.05，说明方程的模拟较好；确定系数R2=0.989 9，校正决定系数R2Adj=0.979 7，说明模型方程与试验拟合度好，误差小，该模型可以较好地预测试验结果。A、C、D、BC、BD、A2、B2、C2和D2均达到极显著水平（P0.01），B、AC达到显著水平（P0.05），其余各项对玉米须总黄酮提取量影响均不明显。4个因素的影响程度为CDAB。各因素交互作用对总黄酮提取量的影响见图5。响应曲面坡度越陡峭，说明各因素对提取量的影响越大；反之，对响应值影响越小。由图5可知，微波功率、提取时间、液料比对总黄酮提取量影响较大，离子液体浓度次之。离子液体浓度和液料比、离子液体浓度和提取时间之间响应曲面走势陡峭，表明两者交互作用显著。图5各因素交互作用对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a1（a）微波功率和离子液体浓度对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a2（b）微波功率和液料比对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a3（c）微波功率和提取时间对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a4（d）液料比和离子液体浓度对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a5（e）离子液体浓度和提取时间对总黄酮提取量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F5a6（f）提取时间和液料比对总黄酮提取量的影响结合单因素试验，分析回归模型，得出该方法准确可靠，玉米须总黄酮的最优提取工艺：微波功率467.11 W、离子液体浓度0.66 mol/L、液料比26.37 mL/g、微波时间29.31 min，理论预计值5.14 mg/g。考虑实际操作的局限，选择微波功率450 W、离子液体浓度0.65 mol/L、提取时间30 min、液料比25 mL/g。进行5次平行试验，得到玉米须总黄酮提取量的平均值为5.21 mg/g，与模型预期的结果差异不显著，表明该模型可以用于拟合分析。2.3提取方法比较试验结果（见表5）分别采用乙醇加热回流法、离子液体加热回流法和离子液体-微波协同提取法在优化的条件下对玉米须黄酮进行提取。由表5可知，离子液体-微波协同法对玉米须黄总酮的提取量为5.21 mg/g，离子液体加热回流法对玉米须黄酮的提取量为3.42 mg/g，75%乙醇加热回流法对玉米须总黄酮的提取量为2.06 mg/g。在相同条件下，离子液体-微波的提取效率远高于其他两种工艺。离子液体具有特殊结构，可以溶解植物纤维素，提取过程会破坏植物细胞壁，因此其独特的结构性质能有效提取天然产物中的活性成分，更好地将玉米须中的黄酮类物质溶出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.T006表5提取方法比较试验结果溶剂液料比/(mL/g)时间/min功率/W温度/℃溶剂浓度提取量/(mg/g)V乙/V[Emim]BF42530450450.65 mol/L5.21V乙/V[Emim]BF425300450.65 mol/L3.4275%乙醇253004575%2.062.4玉米须总黄酮的抗氧化性能2.4.1玉米须总黄酮对羟基自由基的清除率（见图6）由图6可知，样品溶液浓度在50~400 mg/L范围内，随着浓度的增加玉米须总黄酮和VC对羟基自由基清除率随浓度增大呈现递增趋势，呈良好的线性关系。总黄酮和VC对羟基自由基的IC50分别为146.71、177.54 mg/L，玉米须总黄酮对羟基自由基清除力稍强于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F006图6玉米须总黄酮对羟基自由基的清除率2.4.2玉米须总黄酮对DPPH自由基的清除率（见图7）由图7可知，样品溶液浓度在25~175 mg/L范围内，随着浓度的增加玉米须总黄酮和VC对DPPH自由基的清除能力增强，呈良好的线性关系。总黄酮和VC对DPPH自由基的IC50分别为120.42、97.84 mg/L，玉米须总黄酮对DPPH自由基的清除能力稍弱于VC。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.013.F007图7玉米须总黄酮对DPPH自由基的清除率3结论在高速发展的畜牧工业中，传统提取工艺已经不能满足工业生产。以离子液体为提取剂较传统提取方法的效率有很大提高，其特殊的结构性质能够更好地溶解出玉米须中的黄酮类物质，具有工艺简单、溶剂可回收、环保及效率高的特点。采用离子液体-微波协同法提取玉米须中的总黄酮，得到最佳提取工艺：微波功率450 W、离子液体浓度0.65 mol/L、提取时间30 min、液料比25 mL/g。在此优化工艺条件下，玉米须总黄酮提取量可达5.21 mg/g。抗氧化试验结果表明，玉米须总黄酮的抗氧化能力较好，能够作为天然的抗氧化剂应用于畜牧生产中，为黄酮类化合物在畜牧领域的应用提供了更多的选择。