射干（Belamcanda chinensis ( L) DC.）为鸢尾科植物。2020版《中华人民共和国药典》中记载，射干以根茎入药，具有清热解毒、利咽、消炎等功效，用于治疗热毒痰火郁结、痰涎壅盛、咳嗽气喘等病症[1]。现代中药研究指出黄酮类化合物是射干主要的化学成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等药理作用[2-3]。射干的茎、叶、花、果实和根均含有黄酮类成分，且不同部位含量不同，射干叶中的总黄酮含量远高于射干根。目前，射干利用的绝大部分是干燥根茎，而射干叶很少被利用，甚至会被丢弃，造成射干资源的极大浪费。近年来，在畜牧养殖行业，寻找抗生素的替代品迫在眉睫。中草药作为饲料添加剂应用于养殖动物疾病的防治，不仅可以提高畜禽的生长性能，还可以降低药物残留[4]。邓素平等[5]研究发现，射干中的异黄酮类和三萜类物质为其主要的抗病毒成分，可以作为防治鸡传染性喉气管炎的有效成分。发酵中草药是指借助微生物的作用，在适当的接种量、温度、时间、湿度条件下对中草药进行发酵，不仅可以提高中草药的有效成分，还可以降低毒性，减少毒副作用[6]，从而作为绿色饲料添加剂更好地替代抗生素[7]。本试验设置添加与不添加碳源、液料比两个不同的变量，通过植物乳杆菌对射干叶进行固态发酵，探究发酵对射干叶总黄酮、总酚含量、抗氧化能力和5种有效成分的影响，为发酵射干叶作为饲料添加剂代替抗生素治疗动物疾病提供参考，促进射干非药用部位的开发与利用。1材料与方法1.1药材与试剂芦丁标准品（质量分数99%）、没食子酸、2, 2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2, 2′-联氨-双二胺盐（ABTS）、Folin-Ciocalteu试剂、水溶性维生素E（美国Sigma 公司），无水乙醇、10% AlCl3溶液、5% NaNO2溶液、4% NaOH溶液、Na2CO3溶液（实验室配制），葡萄糖、植物乳杆菌（ATCC8014）（苏州达麦迪生物医学科技有限公司），鸢尾苷、野鸢尾苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、鸢尾黄素、色谱级乙腈（成都普瑞法科技有限公司），射干叶采自河北工程大学校园。1.2仪器设备Agilent 1100系列高效液相色谱仪、UV检测器、Agilent色谱工作站、大功率破壁机、KQ－100DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），ST8R台式高速冷冻离心机（美国赛默飞），HH-S恒温水温箱（天津赛德利试验分析仪器制造厂），普析TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），千分位电子电子天平（青岛聚创环保设备有限公司），LDO-101-1电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司），高压蒸汽灭菌锅，超净工作台。1.3试验方法1.3.1射干叶预处理新鲜的射干叶流水洗净，于50 ℃恒温干燥箱中干燥，烘干后粉碎，过60目筛，密封保存。1.3.2发酵工艺称取射干叶粉3 g，按照不同液料比加入蒸馏水，于121 ℃灭菌20 min，冷却，在超净工作台中加入800 μL植物乳杆菌溶液，菌液浓度配置为1 g/mL，30 ℃恒温培养7 d后得到发酵产物即射干叶发酵醪。称取3 g射干叶粉，加入液料比为4 mL/g的蒸馏水，灭菌，按照上述操作进行发酵作为对照组。1.3.2.1添加与不添加碳源对射干叶发酵醪的影响称取3 g射干叶粉2份，液料比4 mL/g，1份添加碳源（1 g葡萄糖），1份不添加碳源。灭菌后加入植物乳杆菌，经固体发酵后得到添加碳源发酵醪（G1）和不添加碳源射干叶发酵醪（G0），同时设置对照组，试验重复3次。1.3.2.2不同液料比对射干叶发酵醪的影响分别称取射干叶粉3 g，按照液料比3、4、5、6、7 mL/g加入蒸馏水，不添加碳源，灭菌后加入植物乳杆菌，发酵得到不同液料比射干叶发酵醪，试验重复3次。1.3.3射干叶发酵醪中的成分提取将射干叶发酵醪于50 ℃恒温干燥箱中干燥，精密称取20 mg，加入60%乙醇，置于超声波清洗机中，在超声功率80 W、超声温度70 ℃、超声频率40 kHz条件下提取30 min。5 000 r/min离心3 min。沉淀复提1次后，得上清液，-20 ℃保存，用于总黄酮、总酚和抗氧化活性测定[8]。1.3.4射干叶发酵醪中的总黄酮含量、总酚含量和抗氧化能力测定1.3.4.1总黄酮含量测定精确称量10.0 mg芦丁标准品，配置浓度为1.0 g/L的标准芦丁母液，分别稀释成浓度为0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 g/L的梯度溶液，吸取各梯度500 µL至10 mL离心管中，分别加入4 mL 60%乙醇，100 µL 5% NaNO2溶液，混匀，室温静置6 min；加入100 µL 10% AlCl3溶液，混匀，室温反应6 min；最后加入300 µL 4% NaOH溶液，室温显色反应10 min；空白对照用60%乙醇[9]。使用紫外可见分光光度计，调至510 nm波长处测定各反应液的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度（g/L）为横坐标，得出线性回归方程为y=1.029 5x-0.001 8，R2=0.999 2。移液枪各吸取1.3.3中500 µL上清液，分别加入离心管中，按芦丁标准曲线的方法进行样品总黄酮含量测定，记录各样品的吸光度，代入线性方程，计算总黄酮含量。总黄酮含量=浓度×提取剂总量(mL)/样本重(g)(1)1.3.4.2总酚含量测定精密称取10.0 mg没食子酸标准品，使用蒸馏水配置终浓度为1.0 g/L的没食子酸标准品母液；依次稀释成浓度为5、10、20、30、40、50、100 mg/L的梯度溶液；取各梯度200 µL至10 mL离心管中，分别加入200 µL Folin-Ciocalteu试剂，充分混匀黑暗反应8 min；加入600 µL Na2CO3（7.5%），4 mL蒸馏水，40 ℃水浴30 min[10]。在765 nm下测定反应液的吸光度，重复3次。以吸光度为纵坐标，浓度(g/L)为横坐标，得回归方程y=4.956 8x+0.014 3，R2=0.999 9。根据1.3.3中方法提取上清液，移液枪各吸取200 µL分别加入离心管中，按没食子酸标准曲线的方法进行样品总酚含量测定，记录各样品的吸光度，代入线性方程，计算总酚含量。总酚含量=浓度×提取剂总量(mL)/样本重(g)(2)1.3.4.3DPPH自由基清除率的测定精确称取1 mg DPPH，使用甲醇溶液定容至100 mL，得到浓度为0.01%的DPPH反应溶液，避光备用。分别将1.3.3样品提取液稀释成浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 g/L。取300 µL不同浓度的样品稀释液，加入1.2 mL的DPPH反应液，摇匀后，室温避光静置30 min，于波长为517 nm处测得反应液吸光度（A样品），同时将甲醇反应液的吸光度作为空白（A空白），重复3次取平均值。根据DPPH自由基清除率公式，计算不同浓度下样品DPPH自由基清除率，以样品浓度为横坐标、DPPH清除率为纵坐标绘制曲线。通过GraphPad Prism软件计算出不同浓度下样品自由基清除率的IC50值。DPPH自由基清除率=(1-A样品/A空白)×100%(3)1.3.4.4ABTS+自由基清除能力的测定称取384.08 mg ABTS使用蒸馏水定容至100 mL，配制成浓度为7 mmol/L的ABTS溶液，称取66.284 mg K2S2O8，用蒸馏水定容至100 mL，配制成浓度为2.45 mmol/L的K2S2O8溶液。将上述2种溶液各取10 mL，混匀后避光放置12~16 h，得到工作液母液。加入适量的无水乙醇稀释，测定波长为734 nm的吸光度为（0.7±0.02），得到工作液。然后吸取750 μL工作液和100 μL待测射干叶发酵醪溶液混合摇匀，室温下避光反应6 min后，于734 nm处测吸光度（A样品），使用无水乙醇代替样品液作为对照测定吸光度（A空白），按照公式（4）计算ABTS+自由基清除率。ABTS+自由基清除率=(1-A样品/A空白)×100%(4)以水溶性维生素E（Trolox）作为标准品，用无水乙醇稀释成浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 μmol/L的标准品溶液。以标准品浓度为横坐标，ABTS+自由基清除能力为纵坐标，得到线性回归方程y=0.000 7x+0.001 7，R2=0.993 8。以每克射干叶发酵醪干粉内Trolox抗氧化活性当量为单位（μmol/g）1.3.5射干叶发酵醪中5种有效成分含量测定1.3.5.1对照品溶液制备精密称取适量的鸢尾苷、野鸢尾苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、鸢尾黄素对照品，使用75%甲醇溶解并定容至25 mL，作为对照品溶液。1.3.5.2供试品溶液制备精密称取对照组、不添加碳源射干叶发酵醪0.5 g（精确至0.000 1 g）至10 mL离心管，加入75%甲醇10 mL，超声1 h，3 000 r/min离心5 min，上清液移入新的离心管中，残渣再重复提取1次，合并上清液，冷却至室温，使用75%甲醇定容至刻度，0.45 µm微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。1.3.5.3色谱条件利用HPLC测定射干叶发酵醪中5种有效成分。色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGII 250 mm × 4.6 mm，5 µL；预柱：Alltech C18 guard column（7.5 mm × 4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（B）及0.4%冰醋酸（A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：269 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。梯度洗脱条件见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.T001表1洗脱梯度条件时间/minA/mLB/mL0~2592~838~1725~3583~9117~1935~4581~7919~2145~6079~7421~2660~6574~6026~4065~7560~5040~501.3.5.4标准曲线的制定精密吸取混合对照品溶液至5个不同体积置量瓶中，75%甲醇定容至刻度，进样10 µL测定。以峰面积y为纵坐标，浓度x（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线，发酵后射干叶黄酮类成分标准曲线见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.T002表2发酵后射干叶黄酮类成分标准曲线项目标准曲线R2鸢尾苷y=44 311.53x+12 491.520.999 982野鸢尾苷y=38 237.83x+10 335.420.999 985野鸢尾黄素y=51 085.08x+15 155.860.999 981次野鸢尾黄素y=44 564.57x+14 643.150.999 977鸢尾黄素y=57 796.35x+18 222.630.999 9772结果与分析2.1发酵对射干叶总黄酮含量的影响（见图1、图2）由图1、图2可知，发酵增加了射干叶中总黄酮含量。不添加碳源的射干叶发酵醪（G0）总黄酮含量比对照组提高108.93%，比添加碳源射干叶发酵醪（G1）提高了82.97%。液料比显著影响了射干叶发酵醪中的总黄酮含量。液料比为4 mL/g时，射干叶发酵醪中的总黄酮含量最高，达到62.12 mg/g，但随着液料比的继续增加，射干叶发酵醪中总黄酮含量反而下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F001图1碳源对射干叶发酵醪总黄酮含量影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F002图2液料比对射干叶发酵醪总黄酮含量影响2.2发酵对射干叶总酚含量的影响（见图3、图4）由图3、图4可知，射干叶固态发酵后总酚含量显著增加。不添加碳源的总酚含量比添加碳源提高了17.14%。不同液料比射干叶发酵醪的总酚含量无显著差异。不添加碳源进行射干叶发酵提高了总酚的含量，但液料比对射干叶发酵醪总酚含量影响较小。结合总黄酮含量的变化，最佳发酵条件为不添加碳源、液料比为4 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F003图3碳源对射干叶发酵醪总酚含量影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F004图4液料比对射干叶发酵醪总酚含量影响2.3发酵对射干叶抗氧化活性的影响2.3.1DPPH自由基清除率测定结果2.3.1.1碳源对射干叶发酵醪DPPH自由基清除率的影响（见图5、表3）由图5可知，不添加碳源射干叶发酵醪（G0）DPPH自由基清除率高于添加碳源射干叶发酵醪（G1）；添加碳源射干叶发酵醪DPPH自由基清除率低于对照组，表明添加碳源会降低DPPH自由基清除率。IC50值是评价抗氧化力强弱的重要指标，抗氧化性强弱与IC50值成反比，即IC50值越小，表明抗氧化能力越强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F005图5碳源对发酵射干叶发酵醪DPPH自由基清除率的影响由表3可知，不添加碳源射干叶发酵醪（G0）IC50值（0.347 3%）低于对照组IC50值（0.453 8%）和添加碳源射干叶发酵醪(G1）（0.516 1%），表明不添加碳源可以提高射干叶发酵醪抗氧化能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.T003表3碳源对射干叶发酵醪DPPH自由基清除率IC50值的影响项目对照组G0组G1组IC500.453 80.347 30.516 1%2.3.1.2液料比对射干叶发酵醪DPPH自由基清除率的影响（见图6、表4）由图6可知，不添加碳源、不同液料比射干叶发酵醪对DPPH自由基清除率高于对照组。液料比的影响作用呈现先升高然后逐渐降低的趋势。当液料比为4 mL/g时，DPPH自由基清除率达到最高。抗氧化能力与黄酮含量呈正相关，DPPH自由基的清除率随着提取物黄酮浓度的增加而增大[11]。发酵后射干叶在不同浓度下抑制自由基的能力有所差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F006图6液料比对射干叶发酵醪DPPH自由基清除率的影响由表4可知，在试验浓度范围内，液料比为4 mL/g时，射干叶发酵醪的IC50值最低，表明具有较好的DPPH自由基清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.T004表4液料比对射干叶发酵醪DPPH自由基清除率IC50值的影响项目液料比/(mL/g)34567IC50/%0.468 30.347 30.367 20.419 60.444 92.3.2ABTS+自由基清除力测定结果（见图7、图8）由图7、图8可知，不添加碳源射干叶发酵醪（G0）对ABTS+自由基的清除能力高于添加碳源射干叶发酵醪（G1）和对照组。不添加碳源、不同液料比条件下，射干叶发酵醪对ABTS+自由基清除能力排序为液料比4 mL/g＞液料比5 mL/g＞液料比7 mL/g＞液料比6 mL/g＞液料比3 mL/g，表明液料比在4 mL/g时，发酵醪对ABTS+自由基的清除力最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F007图7碳源对射干叶发酵醪ABTS+自由基清除能力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.F008图8液料比对射干叶发酵醪ABTS+自由基清除能力的影响2.4射干叶发酵醪中5种黄酮类有效成分含量测定结果（见表5）由表5可知，发酵后射干叶中鸢尾黄素、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量分别比对照组提高了28.39%、17.36%和30.35%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.016.T005表5发酵后射干叶5种黄酮类成分含量变化项目对照组射干叶射干叶发酵醪鸢尾苷0.000 000±0.000 0000.000 000±0.000 000野鸢尾苷0.021 000±0.000 0440.000 000±0.000 000野鸢尾黄素1.201 000±0.002 8371.942 000±0.005 817次野鸢尾黄素0.190 000±0.000 3170.223 000±0.001 112鸢尾黄素0.313 000±0.000 6280.408 000±0.003 417mg/g3讨论3.1碳源对射干叶发酵醪的影响本试验以射干叶作为发酵原料，以植物乳杆菌为菌种，30 ℃恒温发酵7 d，利用超声波振荡提取法得到射干叶发酵产物，即射干叶发酵醪的提取液。采用亚硝酸钠-氯化铝比色法测定总黄酮的含量、利用福林酚法测定总酚的含量，进一步使用HPLC测定射干叶发酵醪中5种黄酮类有效成分的含量变化。结果表明，相比对照组，不添加碳源的试验组总黄酮和总酚含量均显著提高，发酵后的射干叶总黄酮含量比对照组提高108.93%，发酵后的总酚含量比对照组提高20.98%。在发酵阶段，添加碳源与不添加碳源相比，不添加碳源更能有效提高总黄酮和总酚的含量。刘卢生等[12]研究发现，当发酵物中含有足够多的葡萄糖时，pH值会迅速降低，达到4以下，低pH值抑制了乳酸菌继续生长繁殖，导致葡萄糖对紫花苜蓿进行发酵的促进作用并不明显[12]。3.2液料比对射干叶发酵醪的影响本研究从总黄酮含量、总酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率4个方面均得出相同结论，不同液料比会影响发酵后射干叶成分含量和抗氧化活性，其中液料比为4 mL/g时，发酵后射干叶的总黄酮和总酚含量最高，分别达到了62.17、13.35 mg/g，且抗氧化能力最强。文培华等[13]研究发现，虎耳草的抗氧化活性与黄酮的含量呈正相关。张祺祺等[14]研究发现，抹茶茶汤中的多酚含量及体外抗氧化活性存在正相关关系，但影响不显著。本试验中，当液料比为4 mL/g时，射干叶中总黄酮和总酚含量最高、抗氧化能力最强。相关研究发现，在动物生产中应用射干不仅对治疗产蛋鸡传染性支气管炎具有明显效果，而且还可以促进肉鸡生长，具有良好的防病效果[15-16]。3.3HPLC测定射干叶发酵醪有效成分分析本研究发现，发酵后射干叶中鸢尾黄素、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量比对照组均有所增加。张晓瑞等[17]研究发现，利用枯草芽孢杆菌发酵能够提高射干根鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量，表明发酵可以增加射干有效成分的含量。4结论在不添加碳源、液料比为4 mL/g条件下对射干叶进行固体发酵，可以有效提高总黄酮和总酚的含量，增强抗氧化能力。本研究为射干作为绿色饲料添加剂、代替抗生素治疗家禽疾病提供一定的参考。