莲黄颗粒由穿心莲、黄芩、白头翁、秦皮及诃子等8味中药组方经提取、浓缩及制粒制备而成，具有清热燥湿、凉血止痢的功效，临床中主要用于畜禽细菌性腹泻，如大肠杆菌、沙门氏菌及魏氏梭菌等引起的肠道疾病[1]。现代药理表明，莲黄颗粒中的穿心莲、黄芩、白头翁及秦皮等具有抗菌、消炎及拮抗细菌内毒素的作用[2-4]。莲黄颗粒质量标准收录于《兽药质量标准》2017年版（中药卷）。质量标准中只有性状和薄层色谱鉴别，无含量检测项，不能有效判定产品的质量和稳定性，因此建立莲黄颗粒有效成分含量测定对评价莲黄颗粒质量具有重要意义。鸡沙门氏菌病是以鸡白痢、鸡伤寒为代表的常见疾病，该病发病率高、危害性大，临床以败血症和肠炎为主要症状，影响鸡的生产性能和蛋品质，给养禽业造成巨大的经济损失[5-7]。抗生素在防控沙门氏菌感染方面发挥重要作用，但抗生素大剂量长时间应用导致菌株耐药性增强，抗生素使用效果显著降低[8]。为降低细菌耐性，减少食品中抗生素残留对人体危害，迫切需要新的防治沙门氏菌病的产品替代抗生素。而中兽药具有不易出现耐药性、毒副作用少、效果显著等特点。本试验建立HPLC检测连黄颗粒中成分含量的方法，研究莲黄颗粒体内外对沙门氏菌的作用效果，为其临床应用提供依据。1材料与方法1.1材料1.1.1药物与试剂没食子酸（110831-201906）、秦皮甲素（110740-201806）、秦皮乙素（110741-202109）、黄芩苷（110715-202122）、穿心莲内酯（110797-202010）、脱水穿心莲内酯（110854-202111），由中国食品药品检定研究院提供；莲黄颗粒（202203017、202203022、202204015、202205010、202205019、202206003）由保定冀中生物科技有限公司提供；沙门氏菌HYM2由吉林大学邓旭明老师惠赠；乙腈，色谱纯（TFE000136），由默克股份两合公司提供；磷酸，色谱纯（20191029），由天津市致远化学试剂有限公司提供。1.1.2仪器设备e2695高效液相色谱仪、2489紫外检测器（Waters有限公司），AS系列超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1高效液相色谱条件色谱柱为C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B。流动相洗脱比例和波长见表1，流速为1 mL/min，进样量为10 μL，柱温为30 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T001表1流动相洗脱比例和波长流动相波长时间/min乙腈比例/%0.1%磷酸比例/%时间/min波长/nm0~305~5095~500~827230~4050~8050~208~1633440~4580~520~9516~2128045~5059521~502251.2.2对照品和供试品的制备混合对照品溶液的制备：分别精密称取对照品穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、秦皮甲素、秦皮乙素、黄芩苷及没食子酸，使用甲醇定容至25 mL，配制浓度分别为0.33、0.25、0.24、0.10、0.15、0.20 g/L的对照品储备液。精密量取各个对照品储备液，加甲醇定容至10 mL，即为混合对照品溶液。供试品溶液的制备：称取研细的莲黄颗粒约1 g，放入50 mL容量瓶中，加入一定量的50%甲醇，超声处理20 min，冷却，50%甲醇定容至50 mL，摇匀，过滤即为供试品溶液。1.2.3莲黄颗粒阴性样品的制备诃子阴性莲黄颗粒：穿心莲180 g、黄芩180 g、白头翁180 g、马齿苋240 g、秦皮120 g、地榆120 g、甘草120 g，按照莲黄颗粒的质量标准制备颗粒。秦皮阴性莲黄颗粒：穿心莲180 g、黄芩180 g、白头翁180 g、诃子120 g、马齿苋240 g、地榆120 g、甘草120 g，按照莲黄颗粒的质量标准制颗粒。黄芩阴性莲黄颗粒：穿心莲180 g、白头翁180 g、诃子120 g、马齿苋240 g、秦皮120 g、地榆120 g、甘草120 g，按照莲黄颗粒的质量标准制备颗粒。穿心莲阴性莲黄颗粒：黄芩180 g、白头翁180 g、诃子120 g、马齿苋240 g、秦皮120 g、地榆120 g、甘草120 g，按照莲黄颗粒的质量标准制备颗粒。1.2.4莲黄颗粒体外抗沙门氏菌效果研究采用打孔法测定莲黄颗粒对沙门氏菌的体外抑菌性[9-10]。沙门氏菌接种至LB液体培养基中培养过夜，调整菌数为1.0×105 CFU/mL，取100 μL菌液在平板涂布，并用打孔器打孔，每个平板打3孔，重复3次，每个孔中加入100 μL浓度为0.5 g/mL的莲黄颗粒溶液，对照孔加入灭菌后的蒸馏水，37 ℃培养12 h，十字交叉法测定抑菌圈直径，计算抑菌率。抑菌率=(莲黄颗粒抑菌圈-对照抑菌圈)/莲黄颗粒抑菌圈×100%(1)采用微量液体培养基倍比稀释法测定莲黄颗粒对沙门氏菌的最低抑菌浓度[11]，使用无菌96孔平底微量培养板倍比稀释不同浓度的莲黄颗粒溶液，每孔加入菌数为1.0×105 CFU/mL的沙门氏菌菌液100 μL，37 ℃培养12 h，显微镜下涂板观察，视野中菌数少于5，即为最低抑菌浓度。1.2.5莲黄颗粒体内抗沙门氏菌效果研究选取75只1日龄肉雏鸡（37~40 g），每只灌胃20 mg链霉素，适应性饲养3 d后，分为5组，为健康对照组、模型组、阳性药物氟苯尼考组、莲黄颗粒组、氟苯+莲黄组，每组3个重复，每个重复5只雏鸡。建立沙门氏菌感染雏鸡模型[12-13]，给药7 d，具体处理见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T002表2莲黄颗粒体内抗沙门氏菌试验分组及处理组别处理方案健康对照组正常隔离饲养，每只鸡灌服1 mL生理盐水，1 h后灌服生理盐水1 mL模型组每日以1×107 CFU/只供沙门氏菌，给菌1 h后灌服生理盐水1 mL氟苯尼考组每日以1×107 CFU/只供沙门氏菌，给菌1 h后以1.5 mL/L兑水剂量灌服氟苯尼考溶液莲黄颗粒组每日以1×107 CFU/只供沙门氏菌，给菌1 h后以0.25 g/只剂量灌服莲黄颗粒氟苯+莲黄组每日以1×107 CFU/只供沙门氏菌，给菌1 h后以1 mL/L兑水剂量灌服氟苯尼考溶液，以0.25 g/只剂量灌服莲黄颗粒相对增长率=(7 d各组平均体重-攻菌前各组平均体重)/健康对照组平均增重×100%(2)对每组鸡剖检，观察病变并取肝脏和盲肠，经4%甲醛溶液固定后，HE染色，进行病理组织学分析。2结果与分析2.1专属性考察由图1可知，在与没食子酸对照品、秦皮甲素、秦皮乙素、黄芩苷、穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯保留时间一致处，莲黄颗粒中均有对应的峰，且无峰干扰，因此该方法专属性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F001图1HPLC色谱图2.2线性关系考察精密量取1.2.2项下对照品储备液适量，使用甲醇配制成没食子酸浓度为10、25、30、40、50 mg/L对照品，秦皮甲素浓度为4.8、9.6、14.4、19.2、24 mg/L对照品，黄芩苷浓度为80、160、240、320、400 mg/L对照品，穿心莲内酯4.8、9.6、14.4、19.2、24 mg/L对照品，按照1.2.1项下色谱条件测定，计算回归方程和相关系数，结果见表3。由表3可知，没食子酸、秦皮甲素、黄芩苷及穿心莲内酯在相应浓度范围内具有良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T003表34种对照品的线性关系对照品线性方程相关系数线性范围/(mg/L)没食子酸Y=27 340X+721 660.9995~50秦皮甲素Y=24 303X+107 3120.9992~20黄芩苷Y=32 911X+309 960.99940~400穿心莲内酯Y=19 812X+135 8610.9992~202.3精密度考察取莲黄颗粒供试品溶液，连续进样6次，按照1.2.1项下色谱条件测定，计算没食子酸、秦皮甲素、黄芩苷及穿心莲内酯的峰面积的RSD值分别为0.58%、0.39%、0.21%、0.76%，表明该方法精密度良好。2.4重复性考察取同一莲黄颗粒样品，按照1.2.2法平行制备6份供试品溶液，按照1.2.1项下色谱条件测定，计算得到没食子酸、秦皮甲素、黄芩苷、穿心莲内酯的峰面积RSD值分别为0.77%、0.42%、0.19%、0.68%，表明该方法重复性良好。2.5稳定性考察取同一莲黄颗粒供试品溶液，分别取0、2、4、8、12 h供试品溶液，按照1.2.1项下色谱条件测定，计算得没食子酸、秦皮甲素、黄芩苷、穿心莲内酯的峰面积RSD值分别为0.55%、0.38%、0.21%、0.59%，表明该方法稳定性良好。2.6加样回收试验考察精密称取已知成分含量的莲黄颗粒研细粉0.5 g，分别按约80%、100%、120%比例加入4种质量浓度的对照品溶液，按照1.2.1项下制备供试品，计算回收率和RSD值，结果见表4。由表4可知，回收率在97%~102%之间，RSD均小于2.5%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T004表4莲黄颗粒4种成分加样回收率试验结果（n=9）项目本底值/mg加入值/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%没食子酸0.820.6699.7999.581.10.8298.460.82100.270.820.82101.550.8299.890.8298.650.820.9899.170.82100.280.8298.16秦皮甲素0.710.57101.2199.531.00.710.5799.240.710.57100.090.710.798.790.710.799.730.710.799.160.710.85100.280.710.8599.610.710.8597.68黄芩苷9.777.899.6499.681.49.777.8101.439.777.897.589.779.7198.469.779.71100.249.779.71101.819.7711.7298.619.7711.7299.089.7711.72100.33穿心莲内酯0.770.61100.4699.641.20.770.6199.520.770.6198.450.770.76101.340.770.7697.950.770.7698.440.770.9299.090.770.92100.480.770.92101.072.7莲黄颗粒样品含量测定取3批莲黄颗粒，按照上述建立的方法测定4种成分，结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T005表5莲黄颗粒4种成分含量检测结果批号成分含量/(mg/g)202210009没食子酸1.63秦皮甲素1.42黄芩苷19.54穿心莲内酯1.53202210010没食子酸1.60秦皮甲素1.47黄芩苷20.07穿心莲内酯1.49202210011没食子酸1.72秦皮甲素1.41黄芩苷19.11穿心莲内酯1.562.8莲黄颗粒体外抑菌作用效果（见表6）由表6可知，莲黄颗粒对沙门氏菌的抑菌圈为23.4 mm，抑菌率为72.7%，最低抑菌浓度为12.5 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T006表6莲黄颗粒对沙门氏菌的抑菌作用项目抑菌圈/mm抑菌率/%MIC/(g/L)结果23.472.712.52.9莲黄颗粒对肉雏鸡生长性能和组织损伤的影响（见表7、图2）由表7可知，相比健康对照组，模型组鸡相对增长率显著降低（P0.05），而氟苯尼考组、莲黄颗粒组及氟苯+莲黄组鸡相对增重率均显著高于模型组（P0.05）。除健康对照组外，氟苯+莲黄组鸡相对增重率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.T007表7莲黄颗粒对肉雏鸡生长性能的影响组别给药前体重/g给药7 d体重/g相对增长率/%健康对照组68.5±2.1317.4±7.6a100.0±0.0a模型组69.4±1.9170.8±10.4c40.7±2.2c氟苯尼考组66.6±2.4231.8±11.7b66.4±2.5b莲黄颗粒组68.2±1.7251.0±9.5b73.5±1.8b氟苯+莲黄组67.7±3.0306.8±10.8a96.1±3.1a注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05）。由图2可知，对照组鸡肝脏组织结构完整，肝细胞未见变性、坏死。模型组鸡肝窦可见轻微至轻度充血，并有炎性细胞浸润。与模型组鸡相比，氟苯尼考组、莲黄颗粒组及氟苯+莲黄组鸡病理改变不同程度地减轻，其中氟苯+莲黄组减轻更明显。对照组鸡盲肠结构完整，模型组鸡盲肠杯状细胞减少，黏膜上皮细胞脱落，并有炎性细胞浸润，氟苯尼考组、莲黄颗粒组及氟苯+莲黄组病理改变不同程度减轻，氟苯+莲黄组减轻更明显。图2莲黄颗粒对肉雏鸡组织损伤的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F2a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F2a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F2a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F2a410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.023.F2a53讨论穿心莲内酯为穿心莲的主要有效成分，具有抑菌、抗炎及抗病毒的功效[14-15]。秦皮的主要化学成分为香豆素类化合物，秦皮甲素和乙素是秦皮质量控制的主要成分[16]。黄芩苷为黄芩的主要活性成分，其抑菌机制为造成细菌细胞膜损伤而实现抗菌作用[17]。诃子中含有多种化学成分，没食子酸含量是其质量评价的主要成分之一[18]。为更好地监控莲黄颗粒的质量和确保产品的稳定性，提高临床使用效果，本研究对莲黄颗粒的有效成分穿心莲、黄芩、秦皮及地榆多成分进行含量测定，优化了莲黄颗粒样品处理方法和色谱条件。对于供试品的处理，本研究分别加入一定量甲醇、乙醇、50%甲醇及50%乙醇，超声提取定容过滤检测，根据提取率和峰的分离度及杂峰，选择50%甲醇为提取液。在筛选流动相时，比较了甲醇‑水、乙腈‑水、甲醇‑0.1%磷酸溶液、乙腈‑0.1%磷酸溶液系统的分离效果，在恒定比例条件下，4种流动相均不能实现没食子酸、秦皮甲素、秦皮乙素、黄芩苷、穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的有效分离。根据各峰分离度和杂质峰的情况，选用乙腈‑0.1%磷酸溶液系统。本研究使同一液相条件使尽可能多的目标峰分离出来，对含量较高的组分进行含量测定，实现定量研究，建立了穿心莲内酯、秦皮甲素、黄芩苷及没食子酸的测定方法，方法简便、高效。本试验通过打孔法测定莲黄颗粒对沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈为23.4 mm，为高敏，通过微量液体培养基倍比稀释法测定莲黄颗粒对沙门氏菌的最低抑菌浓度12.5 g/L。本试验通过建立鸡只沙门氏菌感染模型测定莲黄颗粒体内对沙门氏菌的作用。雏鸡感染沙门氏菌后采食量降低，精神沉郁。氟苯尼考组、莲黄颗粒及两者联合用药对沙门氏菌导致的雏鸡采食量降低均有改善作用，氟苯尼考和莲黄颗粒联合用药效果最显著。模型组肝组织轻度出血、炎性浸润，盲肠组织杯状细胞减少，上皮细胞脱落，而氟苯尼考组、莲黄颗粒组及两者联合用药组对上述症状均有改善作用，特别是氟苯尼考和莲黄颗粒联合用药组效果最显著。4结论本研究建立的莲黄颗粒HPLC多成分含量测定方法稳定，专属性强。莲黄颗粒体外对沙门氏菌的抑制为高敏，能够改善沙门氏菌感染雏鸡采食量的降低，并能够修复沙门氏菌对肝脏和盲肠的损伤。