新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的急性接触性传染病。为了有效控制该病的发生，多种疫苗、药物及卵黄抗体和高免血清等被应用于新城疫的预防和治疗中，并取得一定的成效。但新城疫仍在国内部分鸡场流行，给养鸡生产造成巨大损失。研究人员一方面尝试研发高效低毒新城疫疫苗以提高对鸡群的保护，另一方面也从我国传统医药资源中寻找合适的药物或组方对该病进行预防和治疗[1-4]。中草药具有来源丰富、毒副作用小的优点[5-7]。紫花地丁（Viola yedoensis Makino）作为常用的清热解毒类药物，性苦、寒，入心、肝经，具有重要的药用价值。现代药理研究表明，香豆素是紫花地丁的重要活性成分，具有抗菌、抗炎、抑制免疫细胞活性及清除自由基等作用[8-10]，在临床上多用于治疗咽炎和乳房炎、痢疾、黄疸及目赤肿痛等[11]。紫花地丁提取物可以缓解小鼠溃疡性结肠炎的炎症反应，抑制鲤春病毒血症病毒的增殖和体内载毒量，对乙型肝炎病毒（HBV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、柯萨奇病毒、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）具有明显的抑制作用[12-16]。香豆素类成分是紫花地丁发挥活性的重要物质基础，紫花地丁中香豆素类成分的检测和纯化方面的研究相对缺乏[17]。关于紫花地丁提取物对新城疫病毒体外增殖的抑制作用鲜有报道。因此，本试验制备紫花地丁中香豆素类提取物，探究紫花地丁香豆素类提取物体外对新城疫病毒的抑制作用，利用CCK-8方法检测紫花地丁香豆素类提取物对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞的影响，以期为植物天然化合物对新城疫的防治提供参考。1材料与方法1.1试验材料紫花地丁购自郑州市兽药药材批发市场。新城疫病毒毒株为河南科技学院动物科技学院预防兽医学实验室分离，鸡胚尿囊液扩增后-20 ℃保存。鸡胚成纤维细胞DF-1由河南科技学院动物科技学院欧长波老师馈赠。1.2试剂和仪器试剂：DMEM培养基、cell counting kit-8试剂（CCK-8）购自索莱宝公司，秦皮甲素标准品和秦皮乙素标准品（批号：305-01-1/305-01-2）购自上海源叶生物科技有限公司。仪器：LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津），CO2细胞培养箱（德国默克科技公司），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），G154TW高压灭菌锅（上海富士工器有限公司），TE2000-U型倒置显微镜（Nikon公司产品），SHE-300型酶标分析仪（北京赛尔福知心科技有限公司）。1.3试验方法1.3.1紫花地丁香豆素类提取物的制备及提取物中两种香豆素的检测紫花地丁香豆素提取物（VCE）的制备参考文献[18]的方法，并进行优化。提取溶剂70%乙醇、液料比50 mL/g、提取5次、每次1 h，合并3次滤液并减压浓缩。浓缩物水悬液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取物分别减压浓缩。按照高效液相色谱检测方法检测各个萃取部位的秦皮甲素和秦皮乙素含量，确定香豆素类化合物的富集部位，萃取物均冻干。参考徐小博等[19]的方法，利用高效液相色谱法测定提取物中两种香豆素的含量。色谱条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3 C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）。洗脱方法为：0~2 min，10%甲醇；2~10 min，10%~25%甲醇；10~20 min，25%~60%甲醇；缓冲盐为1‰的磷酸。检测波长为340 nm，进样量为10 μL，柱温30 ℃。1.3.2NDV滴度的测定将DF-1（鸡胚成纤维细胞）以细胞浓度1×105 个/mL加入96孔细胞培养板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜；将病毒原液用无血清的DMEM培养基进行10倍比稀释，稀释时由高浓度到低浓度依次吹打混匀；弃去96孔细胞培养板内旧的细胞培养液，1×PBS冲洗1~2次后吸去PBS；按稀释倍数逐个将病毒稀释液加入96孔细胞培养板中，每孔6个重复，同时设置一列空白对照组（无病毒液、无细胞）和一列正常细胞对照组；观察细胞病变效应，做好记录；参照Reed-Muench法计算病毒半数组织培养感染剂量TCID50[20]。1.3.3CCK-8法检测紫花地丁香豆素类提取物对DF-1细胞毒性作用通过细胞计数制备浓度为1×105 个/mL的DF-1细胞悬液，96孔板中各孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜；用无血清的DMEM培养基将紫花地丁香豆素类提取物倍比稀释，药物浓度分别为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000、400.000 mg/L；倒置显微镜下观察细胞贴壁及增殖情况，当细胞铺满96孔板底部70%~80%以上时，弃去旧细胞培养液，用1×PBS冲洗细胞1~2次，吸去PBS；加入各浓度的紫花地丁香豆素类提取物，每孔100 μL，每个稀释浓度4~6个重复，同时设置空白对照组（无细胞）和正常细胞组，37 ℃、5% CO2培养箱培养；培养24 h，取出96孔细胞培养板，弃去培养基，PBS清洗后在各孔均加入100 μL无血清的新鲜DMEM培养基和10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h；酶标仪检测450 nm下的吸光度。阳性对照选用抗病毒药物利巴韦林，试验方法同样品组。1.3.4紫花地丁香豆素类提取物对NDV复制抑制作用通过细胞计数制备浓度为1×105 个/mL的DF-1细胞悬液，96孔板中各孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜；当细胞覆盖底部面积达到70%～80%时，弃去96孔板内原有细胞培养液，1×PBS冲洗1~2次；每孔加入100 TCID50/mL病毒液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱孵育病毒2 h，同时设置空白对照组和细胞对照组；弃去NDV病毒液，1×PBS冲洗1~2次，加入不同浓度的紫花地丁香豆素类提取物溶液，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养；直至病毒对照组出现典型的CPE为止，弃去培养基，PBS清洗后在各孔均加入100 μL无血清的新鲜DMEM培养基和10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h；酶标仪测定450 nm下各孔吸光度，并记录数据。1.3.5紫花地丁香豆素类提取物对NDV吸附抑制作用采用细胞计数制备浓度为1×105 个/mL的DF-1细胞悬液，96孔板中各孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜；当细胞覆盖底部面积达到70%~80%时，弃去96孔板内原有细胞培养液，1×PBS冲洗1~2次；每孔同时加入100 TCID50/mL病毒液100 μL和不同浓度紫花地丁香豆素类提取物溶液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱孵育病毒2 h，同时设置空白对照组和纯病毒液对照组；弃去96孔板中所有溶液，1×PBS冲洗1~2次，加入细胞维持液，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养；直至病毒对照组出现典型的CPE为止，弃去培养基，PBS清洗后在各孔均加入100 μL无血清的新鲜DMEM培养基和10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h；酶标仪测定450 nm下各孔吸光值，并记录数据；计算药物对NDV的抑制率。药物对NDV的抑制率=(试验组药物吸光值的平均值-病毒对照组吸光值的平均值)/(正常细胞对照组吸光值的平均值-病毒对照组吸光值的平均值)×100%(1)1.3.6紫花地丁香豆素类提取物对NDV感染前保护作用采用细胞计数制备浓度为1×105 个/mL的DF-1细胞悬液，96孔板中各孔100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱培养过夜；当细胞覆盖底部面积达到70%~80%时，弃去96孔板内原有细胞培养液，1×PBS冲洗1~2次；每孔加入不同浓度的紫花地丁香豆素类提取物溶液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱孵育病毒2 h，同时设置空白对照组和细胞对照组；弃去药物溶液，1×PBS冲洗1~2次，加入100 TCID50/mL NDV液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养2 h；弃去病毒液，1×PBS冲洗1~2次，加入细胞维持液100 μL，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养；直至病毒对照组出现典型的CPE为止，弃去培养基，PBS清洗后在各孔均加入100 μL无血清的新鲜DMEM培养基和10 μL CCK-8，37 ℃、5% CO2培养箱培养2 h；标仪测定450 nm下各孔吸光度，并记录数据，计算紫花地丁香豆素类提取物对NDV的抑制作用。2结果与分析2.1紫花地丁香豆素类提取物中秦皮甲素和秦皮乙素的含量秦皮甲素和秦皮乙素的高效液相色谱图见图1。由图1可知，甲醇为流动相时，高效液相色谱图中秦皮甲素和秦皮乙素的色谱峰峰形均满足要求，秦皮甲素和秦皮乙素两种成分在样品中可以很好地分离。波长为340 nm时，秦皮甲素和秦皮乙素的色谱峰响应高，色谱峰峰型好，且目标化合物与其他成分得到很好的分离。通过对波长的选择、流动相洗脱法的选择，建立了紫花地丁中秦皮甲素和秦皮乙素两种成分含量的高效液相色谱检测方法，检测各个萃取部位的紫花地丁中秦皮甲素和秦皮乙素的含量分别为2.58、7.66 mg/g。图1秦皮甲素和秦皮乙素的高效液相色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.F1a1（a）秦皮甲素10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.F1a2（b）秦皮乙素紫花地丁粗体物依次用乙酸乙酯、正丁醇、石油醚萃取后，3个萃取部位的香豆素含量最高的为乙酸乙酯，含量可达203.47 mg/g。其次，分别为正丁醇（10.34 mg/g）、石油醚（2.36 mg/g）。各萃取部位的检测结果表明，香豆素类化合物主要在乙酸乙酯萃取部位富集。2.2NDV效价的测定（见表1）由表1可知，距离比例=（稀释组内最小50%的病变率百分比-50%）/（稀释组内最小50%的病变率百分比-稀释组内最大50%的病变率百分比）=（81.2%-50.0%）/（81.2%-18.2%）=0.5；lgTCID50=距离比例×稀释度对数间差+稀释组内最小50%的病变率的稀释度对数=0.5×(-1)+(-6)=-6.5。TCID50=10-6.5/100 μL，即为将此NDV稀释10-6.5倍，接种100 μL于DF-1细胞，可使细胞50%发生病变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.T001表1NDV的TCID50结果稀释倍数CPE孔数无CPE孔数比/%总CPE孔数总无CPE孔数累计CPE百分数10-160390100.0（39/39）10-260330100.0（33/33）10-360270100.0（27/27）10-460210100.0（21/21）10-560150100.0（15/15）10-6429281.2（9/11）10-7335550.0（5/10）10-8242918.2（2/11）10-9060150（0/15）10-10060210（0/21）2.3紫花地丁香豆素类提取物对DF-1细胞毒性作用不同浓度紫花地丁香豆素类提取物对DF-1的细胞毒性见表2，不同浓度利巴韦林对DF-1的细胞毒性见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.T002表2不同浓度紫花地丁香豆素类提取物对DF-1的细胞毒性提取物浓度/(mg/L)细胞存活率/%400.00025.035±1.580200.00048.965±1.960100.00069.865±2.52050.00085.318±1.86025.00089.572±2.04012.50092.259±2.0106.25094.392±1.8603.12596.625±2.68010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.T003表3不同浓度利巴韦林对DF-1的细胞毒性提取物浓度/(mg/L)细胞存活率/%4 000.0042.25±2.122 000.0068.14±1.781 000.0075.52±2.32500.0083.78±1.59250.0089.82±2.07125.0092.96±1.8262.5096.89±1.6531.2598.32±1.25由表2、表3可知，紫花地丁香豆素类提取物和利巴韦林均存在一定的细胞毒性，且随着紫花地丁香豆素类提取物和利巴韦林浓度的增大，细胞毒性增强。紫花地丁香豆素类提取物作用于DF-1细胞中的半数致死浓度为185.2 mg/L。2.4紫花地丁香豆素类提取物对NDV复制抑制作用（见图2）由图2可知，紫花地丁香豆素提取物浓度以剂量依赖的方式抑制NDV的复制；且随着药物浓度的不断增加，对NDV的抑制能力不断增强。当提取物浓度为100 mg/L时，抑制率最高，为74.31%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.F002图2紫花地丁香豆素类提取物对NDV复制抑制作用2.5紫花地丁香豆素类提取物对NDV吸附抑制作用（见图3）由图3可知，高浓度紫花地丁香豆素类提取物对NDV吸附DF-1细胞的能力起到抑制作用，当紫花地丁香豆素类提取物作用浓度为100 mg/L时，对NDV吸附抑制率最高，为67.4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.013.F003图3紫花地丁香豆素类提取物对NDV吸附抑制作用3讨论许多中草药及其成分具有很好的抗病毒活性[21]。紫花地丁香豆素类化合物具有良好的生物活性[22]。本研究结果表明，紫花地丁香豆素类提取物对鸡胚成纤维细胞DF-1相对安全，其半数致死浓度为185.2 mg/L。有研究发现，紫花地丁黄酮类提取物在高浓度时抑制IBV吸附与穿入细胞，其抑制IBV吸附与穿入细胞的作用机制可能是紫花地丁黄酮提取物某种活性成分增强了细胞膜的稳定性，通过阻止病毒颗粒吸附靶细胞或抑制病毒在细胞内的复制，使感染细胞受到保护，从而提高了抗病毒能力[23]。本研究通过CCK-8法检测紫花地丁香豆素类提取物在DF-1细胞上可以有效抑制NDV对细胞的吸附和穿入，且这种作用呈浓度依赖性，提取物的浓度越高，其抑制效果越强。本试验发现，NDV稀释10-6.5倍接种100 μL于DF-1细胞，可使DF-1细胞50%发生病变。紫花地丁香豆素提取物浓度以剂量依赖的方式抑制NDV的复制；随着药物浓度的不断增加，对NDV的抑制能力就越强。当提取物浓度为100 mg/L时，对NDV的复制抑制率最高，为74.31%。在NDV吸附抑制中，低浓度紫花地丁香豆素类提取物效果不明显；当紫花地丁香豆素类提取物作用浓度为100 mg/L时，对NDV吸附抑制率最高，为67.4%。有研究表明，从紫花地丁中分离的黄酮类提取物对IBV有较高的抑制活性，对鸡胚肾（CEK）细胞毒性较低，IC50为16.52 mg/L，紫花地丁黄酮类提取物在浓度较高时能抑制IBV吸附及穿入细胞，但其直接灭活IBV吸附的效果更加突出，表明紫花地丁黄酮类提取物具有抗IBV活性[22]。杨佳冰等[24]研究发现，紫花地丁中的总生物碱能够有效地抗鸡新城疫病毒。紫花地丁提取物抗病毒作用可能是多种成分共同作用的结果，不同的提取物抗病毒机理也不尽相同[25]。4结论紫花地丁香豆素类提取物作用于DF-1细胞的半数致死浓度为185.2 mg/L，提取物浓度为100 mg/L时，对NDV的复制和吸附抑制率最高。因此，紫花地丁香豆素类提取物在体外具有明显的抗NDV感染作用，其机理有待进一步探索，也可以作为在体试验的靶标药物进一步研究。