我国鲍鱼产量占全球养殖总量的89.35%[1]。我国鲍鱼养殖主要分布在辽宁、山东、浙江、福建、广东和海南等省[2-3]。不同海域内养殖的鲍鱼品种和数量也存在差异。北方地区主要养殖皱纹盘鲍，而南方地区则更多地养殖杂色鲍[4]。这种差异是由于地理、气候和水温等因素的影响所产生。鲍鱼养殖所需的食物主要来自大型藻类，如红藻、褐藻、蓝藻和绿藻。这些藻类通常以海洋生态系统为基础，能够为鲍鱼提供生长所需的营养物质[5]。然而，由于海域自然条件的限制，一些海域（如渤海湾天津段）无法提供一些大型海藻生长所需要的条件，包括红藻、褐藻、蓝藻和绿藻等。因此，这些地方需要采用人工配合饲料或人工干制海藻作为鲍鱼的食物补充[6]。本课题组前期研究比较了不同饲料对皱纹盘鲍养殖效果的影响，发现人工配合饲料对鲍鱼的生长促进效果最佳，但提高了鲍鱼的死亡率；盐渍龙须菜和裙带菜能够维持较高的鲍鱼存活率，但对鲍鱼的生长促进效果为中等[7]。为进一步探究不同饵料对鲍鱼的生长和存活率的影响机制，本文对人工配合饲料、盐渍龙须菜、盐渍裙带菜投喂下的皱纹盘鲍肝胰腺转录组进行了研究，并结合差异基因分析、功能注释等方法，探究不同饲料对鲍鱼基因功能的影响。1材料与方法1.1试验动物皱纹盘鲍购自天津市王顶堤农贸市场。鲍鱼平均壳长为（5.12±0.48）cm，壳宽（2.64±0.67）cm，体重（15.46±0.87）g。低温运输至循环水养殖实验室。试验前进行14 d的暂养，暂养条件为盐度33‰、pH值7.8、温度（24±1）℃。更替投喂人工饲料、盐渍龙须菜、盐渍裙带菜。暂养期间每天早晚全量换水，及时清除死鲍以及残饵粪便。1.2主要仪器JY10001电子天平（上海精科实业有限公司）、BK-057盐度计（深圳标康科技有限公司）、S101-101-101游标卡尺（上海量具刃具厂有限公司）、温度计、解剖盘、解剖刀、镊子、解剖剪、循环水养殖缸等。1.3试验饲料试验采用饲料为盐渍龙须菜、盐渍裙带菜（均为500 g/袋）以及博发牌配合饲料（12 kg/箱）。所有饲料购自淘宝网，使用时选择新鲜、颜色正常的饲料。不同饲料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.T001表1不同饲料的营养水平项目灰分/(g/100 g)水分/(g/100 g)脂肪/(g/100 g)蛋白质/(g/100 g)总磷/(mg/100 g)总钙/(mg/kg)人工配合饲料14.6113.400.5012.79365.302 283盐渍龙须菜10.8087.500.201.80ND1 490盐渍裙带菜3.4087.300.202.01ND2 020注：“ND”表示未检测，营养水平均为实测值。1.4试验设计及饲养管理试验于天津农学院循环水养殖实验室进行，选择皱纹盘鲍270只，设置配合饲料组（AF）、盐渍龙须菜组（GL）和盐渍裙带菜组（UP），每组90只皱纹盘鲍，每组设置3个平行养殖缸，每个平行养殖缸30只皱纹盘鲍。每日投喂前，将所选盐渍龙须菜、盐渍裙带菜采用淡水清洗掉盐渍和污渍，在过滤海水中泡发24 h，按照鲍鱼体重的5%称量后投喂。配合饲料组每日按照鲍体重2%投喂，直接称量后投喂。所有组均在次日收集、丢弃残饵，并投喂新的饲料。养殖期间每天全量换水1次，及时清除死鲍。试验期2个月。1.5测定指标及方法1.5.1组织取样养殖试验结束后，每个平行养殖缸选取3只鲍鱼，每组共选取9只鲍鱼，采取约100 mg的肝胰腺组织，存放冻存管中，快速存放在液氮中冷冻，转移至-80 ℃的冰箱储存。1.5.2提取RNA对超低温冰箱内保存的肌肉组织进行液氮研磨处理，使用RNA抽提（Trizol）法从肝胰腺组织中提取总RNA。将每组的9个RNA样品进行三三等量混合，构建3个平行RNA混合样品。使用Aligent 2000、Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳检测各混样总RNA的浓度和纯度。1.5.3转录组测序及分析转录组建库及测序工作委托天津诺禾致源有限公司完成。共建立9个转录组文库，并通过Illumina 2100进行双端建库测序。对原始测序序列进行以下生物信息学分析：过滤数据（Clean reads）筛选、测序基因片段（Contig）的拼接和功能注释、基因结构分析、DEseq差异表达基因鉴定、功能基因KEGG富集分析。1.5.4荧光定量PCR验证从转录组结果中随机选择6个差异表达转录本，使用引物设计软件Beacon designer 7设计定量引物。使用反转录合成的互补脱氧核糖核酸（cDNA）为模板，肌动蛋白（β-actin）基因为内参，经过荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪进行定量PCR反应，反应程序设置为：95 ℃ 7 min，(95 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s)×35，72 ℃ 10 min[8]。以循环信号（Ct）值计算每个转录本的相对表达量。2结果与分析2.1不同饲料饲喂皱纹盘鲍差异表达基因数量对比（见图1、表2）由图1和表2可知，人工配合饲料（AF）对皱纹盘鲍肝胰腺转录组的影响较为显著，与盐渍龙须菜（GL）和盐渍裙带菜（UP）相比，表现出更多的上调差异表达基因。此外，GL与UP之间的差异表达基因数量较少，表明两者对皱纹盘鲍肝胰腺转录组的影响可能存在一定的相似性。图1不同饲料饲喂皱纹盘鲍差异表达基因数量对比注：红色代表上调表达，蓝色代表下调表达，黑色代表无显著差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F1a1（a）AF组 vs GL组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F1a2（b）AF组 vs UP组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F1a3（c）GL组 vs UP组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.T002表2不同饲料饲喂皱纹盘鲍差异表达基因数目组别上调差异表达基因个数下调差异表达基因个数AF组 vs GL组3 9361 288AF组 vs UP组4 122733GL组 vs UP组6453992.2不同饲料饲喂皱纹盘鲍肝胰腺转录本表达量（FPKM）分析AF、GL、UP组皱纹盘鲍肝胰腺转录本表达量（FPKM）热图见图2。由图2可知，三组皱纹盘鲍肝胰腺转录整体表达量较为接近，但仍有部分转录本表达呈现显著差异，且高表达量（log2FPKM0）的转录本数量总体多于低表达量的转录本。在3组间的比较中，盐渍龙须菜（GL）和盐渍裙带菜（UP）的转录本表达模式优先聚为一支，表明二者在转录水平上具有较高的相似性。这种相似性可能源于GL和UP中含有的某些共同成分或营养物质，这些成分可能对皱纹盘鲍肝胰腺的生长发育具有相似的影响和调控作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F002图2不同饲料饲喂皱纹盘鲍肝胰腺转录本表达量（FPKM）热图2.3差异表达基因功能注释（见图3）图3不同饲料组的差异表达基因的KEGG富集分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F3a1（a）AF组vs GL组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F3a2（b）AF组vs UP组10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F3a3（c）GL组vs UP组由图3（a）可知，AF组和GL组的差异表达基因主要富集于代谢相关通路、降解相关通路、细胞结构与信号传导相关通路，其中富集最显著的通路是溶酶体通路和淀粉和蔗糖代谢通路。因此，人工饲料（AF）和盐渍龙须菜（GL）投喂的皱纹盘鲍在代谢、降解、转运以及细胞结构与信号传导等生理功能上可能存在显著差异。这些差异可能反映了两组皱纹盘鲍在营养吸收、能量代谢和应对环境压力等方面的不同适应性。如图3（b）可知，AF组和UP组的差异表达基因富集的生物通路与AF组和GL组相仿。其中，富集最显著的通路是溶酶体通路和淀粉与蔗糖代谢通路。此外，还观察到其他一些显著富集的通路，如糖胺聚糖降解通路、半乳糖代谢通路等。结果表明，人工饲料（AF）和盐渍裙带菜（UP）投喂的皱纹盘鲍在代谢、降解、转运以及细胞结构与信号传导等生理功能上可能存在显著差异。由图3（c）可知，GL组和UP组之间的差异基因KEGG富集结果只有氨基糖和核苷酸糖代谢通路和谷胱甘肽代谢通路存在显著差异，说明两者之间的差异生理功能较少。2.4皱纹盘鲍生长和免疫相关功能基因的相对表达量分析根据NR数据库注释信息，提取了其中生长相关的转录本，以及免疫与应激相关的转录本，并调研了它们在不同饲料组中的表达。不同饲料饲喂皱纹盘鲍的生长相关基因和免疫相关基因相对表达量热图见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F004图4不同饲料饲喂皱纹盘鲍的生长相关基因和免疫相关基因相对表达量热图由图4可知，GL组与UP组皱纹盘鲍的生长和免疫应激相关基因，均有较高的相似性，而与AF组的相似性较低。进一步说明了投喂AF和投喂GL或UP的皱纹盘鲍在生长、免疫、应激等生理功能方面存在显著的差别，这一差别可能是造成不同饲料组之间皱纹盘鲍的生长率和存活率表型差异的重要原因。2.5荧光定量PCR验证结果为验证转录组结果的可靠性，选取了6个转录本片段，根据它们的序列克隆了cDNA序列，并使用荧光定量PCR方法监测了它们的表达，结果见图5。由图5可知，荧光定量PCR验证结果与转录组结果的趋势基本一致，说明了转录组测序的结果相对可靠。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.010.F005图5荧光定量PCR验证3讨论本研究发现，人工配合饲料（AF）对皱纹盘鲍肝胰腺转录组的影响与其他组相比差异最为显著，表现为更多的上调差异表达基因。而盐渍龙须菜（GL）和盐渍裙带菜（UP）之间的差异表达基因数量较少，暗示两者对皱纹盘鲍肝胰腺转录组的影响可能存在一定的相似性。本研究结果与之前的表型研究[7]结果相吻合，即人工配合饲料能够显著提高鲍鱼的生长率，但也增加了死亡率。盐渍龙须菜和盐渍裙带菜能够维持较高的鲍鱼存活率，但对鲍鱼的生长促进效果为中等。这可能是由于AF中含有的某些成分对鲍鱼生长和免疫有促进作用，但同时也可能因对水质的污染[9-10]引发对皱纹盘鲍不利的生理反应，从而导致死亡率上升。本研究发现，在差异基因表达功能注释方面，AF与GL和UP在代谢、降解、转运以及细胞结构与信号传导等生理功能上可能存在显著差异。这些差异可能反映了不同饵料组皱纹盘鲍在营养吸收、能量代谢和应对环境压力等方面的不同适应性。其中，两个显著差异的通路是溶酶体通路与淀粉与蔗糖代谢通路。溶酶体是真核生物细胞中的一种膜包囊，其具有降解和吞噬细胞内外的物质的功能。在溶酶体通路中，细胞将需要分解的物质通过内吞作用包裹成小囊泡，随后这些囊泡与溶酶体融合，被降解分解成小分子物质，并释放到细胞内[11-12]。溶酶体通路在维持细胞的代谢平衡和清除细胞内垃圾物质方面起重要作用，在细胞的发育、凋亡和免疫反应等过程中也发挥重要的调节作用[13]。淀粉与蔗糖代谢通路则与碳水化合物的代谢消化息息相关[14-15]。在不同饵料对双齿围沙蚕生长和营养组成的影响研究中也发现，使用不同的饵料投喂会导致沙蚕体内的基因表达发生显著差异。这些基因包括参与氮代谢通路的谷氨酸脱氢酶（GDH）、参与脂肪消化与吸收通路的脂肪酸结合蛋白（FABP）、参与淀粉和蔗糖代谢通路的α-淀粉酶，以及参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的谷草转氨酶基因。大部分均与代谢或消化有关[16]，与本研究的结果相符。生长和免疫相关功能基因的相对表达量分析表明，GL组与UP组皱纹盘鲍在生长、免疫、应激等生理功能方面具有较高的相似性，而与AF组的相似性较低，说明人工饲料对养殖动物生理的影响模式要与天然饵料不同[17-18]。在线纹海马对关键饵料及环境因子的分子响应特征研究中也发现，投喂不同的饵料（卤虫和桡足类）对海马生长相关基因肝脏胰岛素样生长因子1有显著影响，但以卤虫为食的海马肝脏瘦素基因表达量更低，即食欲更强，并且桡足类引起了海马肝脏应激基因热激蛋白70和锰超氧化物歧化酶的高表达[19]。对翘嘴鳜转录组的研究也表明，投喂人工饲料后，翘嘴鳜糖代谢、脂代谢以及摄食相关基因表达量下调，免疫相关基因表达量上调，表明糖脂代谢可能在翘嘴鳜适应人工饲料的过程中有着重要的作用，说明不同饵料对生物生长和抗逆性表型的影响机制可能存在相关转录本的表达[20]。4结论本研究表明，与盐渍龙须菜（GL）和盐渍裙带菜（UP）相比，人工配合饲料（AF）对皱纹盘鲍肝胰腺转录组的影响较为显著，差异表达基因数量更多，且不同饵料对皱纹盘鲍肝胰腺的生长、免疫和应激反应等生理功能的影响具有显著差异。在配备较好水处理设备的循环水工厂化养殖中，人工配合饲料对鲍鱼具有更好的促生长效果。