银耳（Tremella fuciformis）又称白木耳、雪耳和银耳子，富有弹性，柔软洁白[1]。银耳多糖（TFP）是银耳中的主要活性成分之一，具有调节免疫[2]、抗肿瘤[3]、降血糖和血脂[4]、补水保湿[5]、抗氧化衰老[6]、降血糖[7]、降胆固醇[8]、修复大脑记忆损伤[9]等功效。近年来，关于多糖的免疫调节活性及其作为饲料添加剂的研究广受到关注。张恒瑞等[10]研究发现，日粮中添加大枣多糖能够提高黄羽肉鸡的免疫功能和产蛋性能。侯旭东等[11]研究发现，日粮中添加银杏多糖能够提高宫廷黄鸡的免疫功能。但目前关于TFP免疫调节作用机制的研究较少。张浩等[12]研究发现，利用TFP代替抗生素类能够改善仔猪腹泻。本研究旨在阐明TFP对小鼠脾淋巴细胞免疫调节作用及PI3K/Akt、NF-κB信号通路的影响，为TFP的深入研究及其在饲料添加剂方面的开发与利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物8周龄、体重（20±2）g、SPF级Balb/c小鼠购自锦州医科大学生命科学院。将小鼠置于温度在22~26℃，湿度在44%~45%的无菌环境中，自由采食食物和饮水，进行12/12 h的光/暗循环。1.1.2主要药品及试剂银耳多糖（纯度≥90%）购自源叶生物科技有限公司，胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。RPMI-1640培养基、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）和台盼蓝（Trypan Blue）购自北京索莱宝科技有限公司。小鼠白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ）试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，Trizol、超敏ECL化学发光检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和苯甲基磺酰氟（PMSF）购自上海碧云天生物技术研究所。DNase/RNase-Free、Deionized ddH2O由北京天根生化科技有限公司生产，1 000 bp DNA ladder Marker由大连宝生物工程有限公司生产，TaKaRa逆转录试剂盒、TB Green™ Premix Ex Taq ™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒由宝日医生物技术有限公司生产。1.2试验方法1.2.1试验分组在细胞培养板中加入脾淋巴细胞悬液。试验共设6组，CK组每孔加入等体积RPMI-1640完全培养基，LMS组每孔加入等体积含有左旋咪唑（终质量浓度为5 mg/L）的RPMI-1640完全培养基，TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组和TFP 160 mg/L组每孔加入等体积银耳多糖溶液（终质量浓度为20、40、80、160 mg/L）的RPMI-1640完全培养基。1.2.2脾淋巴细胞悬液制备及培养小鼠经颈椎脱臼处死，取出脾脏，研磨，并与RPMI-1640完全培养基制成滤液。离心弃上清，加入Tris NH4Cl，再次离心弃上清，直至红细胞完全裂解。使用RPMI-1640完全培养基重悬细胞，在倒置显微镜下观察，当细胞活力达到95%以上时，将细胞密度调整为5×106个/mL，制成淋巴细胞悬液，接种于细胞培养板，每孔加入淋巴细胞悬液和各试验组所对应的RPMI-1640培养基溶液，每组设置5个复孔，培养条件为温度37 ℃，CO2浓度5%，培养时间为44 h。1.2.3MTT法检测TFP对小鼠脾淋巴细胞增殖变化按照1.2.2方法培养的淋巴细胞，在无菌操作下加入MTT液，继续培养4 h，离心弃上清。每孔再加入DMSO，在570 nm波长处应用酶标仪检测OD值。1.2.4小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ的分泌量按照1.2.2方法培养的淋巴细胞，用ELISA试剂盒检测脾淋巴细胞上清液中IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ的分泌量。1.2.5小鼠脾淋巴细胞IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ mRNA相对表达量按照1.2.2方法培养的淋巴细胞，合并复孔，离心弃上清。加入Trizol提取RNA。核酸蛋白分析仪测定溶解后的RNA溶液的浓度与纯度，根据检测结果调整总RNA溶液浓度。参照TaKaRa逆转录试剂盒的说明进行规范操作，将RNA反转录成cDNA。参照TB Green™ Premix Ex Taq ™Ⅱ试剂盒的说明进行规范操作。混合均匀后，进行Real Time PCR反应。以ACTB为内参，运用2-△△Ct方法得到目的基因的相对表达量。引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.014.T001表1引物序列引物序列长度/bpIL-6F：5'-GCCAGAGCCACATGCTCCTA-3'83R：5'-GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3'IL-10F：5'-GCCAGAGCCACATGCTCCTA-3'145R：5'-GATAAGGCTTGGCAACCCAAGTAA-3'IL-12F：5'-TTCATAAGAGTCAGGTGGTCTTGG-3'86R：5'-CCTTTGGGGAGATGAGATGTG-3'IFN-γF：5'-CGGCACAGTCATTGAAAGCCTA-3'199R：5'-GTTGCTGATGGCCTGATTGTC-3'ACTBF：5'-GATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'171R：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'1.2.6小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关蛋白表达量按照1.2.2方法培养的淋巴细胞，加入细胞裂解液和PMSF（细胞裂解液∶PMSF=100∶1）。参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪检测每孔吸光度值，计算蛋白含量，进行制样。将蛋白质样品进行凝胶电泳，通过转膜操作转移至PVDF膜上，利用脱脂奶粉将膜封闭，与一抗、二抗孵育后，进行显影操作。使用NIH Image J version 1.42q软件分析薄膜的光密度，分析计算目标条带的灰度值，结果表示为目标条带的灰度与β-Actin的比值。1.3数据统计与分析数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1TFP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（见表2）由表2可知，LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组和TFP 160 mg/L组小鼠淋巴细胞刺激指数极显著高于CK组（P0.01），TFP 80 mg/L组小鼠淋巴细胞刺激指数极显著高于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.014.T002表2TFP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响项目CK组LMS组TFP 20 mg/L组TFP 40 mg/L组TFP 80 mg/L组TFP 160 mg/L组淋巴细胞刺激指数1.000±0.000Ee1.813±0.031Aa1.305±0.032Dd1.493±0.037Bb1.807±0.077Aa1.337±0.057Cc注：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。2.2TFP对小鼠脾淋巴细胞因子分泌量的影响（见表3）由表3可知，LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组、TFP 160 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-6、IL-10和IFN-γ分泌量均极显著高于CK组（P0.01）；TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-6、IL-10和IFN-γ分泌量极显著高于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-12分泌量均极显著高于CK组（P0.01）；TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-12分泌量极显著高于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.014.T003表3TFP对小鼠脾淋巴细胞因子分泌量的影响组别IL-6IL-10IL-12IFN-γCK组77.278±0.136Ee61.265±0.314Ee36.939±0.127Dd88.388±0.455EeLMS组91.708±0.509Aa123.523±0.215Aa43.574±0.178Aa134.854±0.707AaTFP 20 mg/L组83.164±0.288Cc77.511±0.182Dd38.897±0.197Cc111.833±0.818CcTFP 40 mg/L组85.632±0.186Bb101.603±0.463Bb40.803±0.203Bb117.013±0.531BbTFP 80 mg/L组91.645±0.258Aa122.93±0.367Aa43.241±0.681Aa133.771±0.675AaTFP 160 mg/L组79.535±1.110Dd79.430±0.273Cc37.203±0.255Dd97.263±0.939Dd注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。ng/L2.3TFP对小鼠脾淋巴细胞因子mRNA相对表达的影响（见表4）由表4可知，LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-6、IL-10和IL-12 mRNA相对表达量均极显著高于CK组（P0.01）；TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IL-6、IL-10、IL-12 mRNA相对表达量极显著高于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.014.T004表4TFP对小鼠脾淋巴细胞因子mRNA相对表达的影响组别IL-6 mRNAIL-10 mRNAIL-12 mRNAIFN-γ mRNACK组1.000±0.000Dd1.000±0.000Dd1.000±0.000Dd1.000±0.000EeLMS组2.153±0.137Aa2.395±0.143Aa3.098±0.106Aa1.860±0.054AaTFP 20 mg/L组1.367±0.027Cc1.459±0.120Cc1.560±0.403Cc1.337±0.014CcTFP 40 mg/L组1.670±0.158Bb1.772±0.015Bb1.951±0.085Bb1.568±0.021BbTFP 80 mg/L组2.072±0.085Aa2.255±0.041Aa2.999±0.110Aa1.843±0.085AaTFP 160 mg/L组0.835±0.103Dd0.994±0.048Dd1.214±0.199Dd1.224±0.062DdLMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组和TFP 160 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ mRNA表达量均极显著高于CK组（P0.01）；TFP 80 mg/L组IFN-γ mRNA表达量极显著高于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。2.4TFP对小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关蛋白的表达影响（见表5）由表5可知，LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组和TFP 160 mg/L组小鼠脾淋巴细胞P-PI3K、IKK-α、NF-κB、IKK-β相关蛋白表达均极显著低于CK组（P0.01）。TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞P-PI3K相关蛋白表达极显著低于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.014.T005表5TFP对小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关蛋白的表达影响组别P-PI3K/PI3KP-Akt/AktIKK-α/β-ActinIKK-β/β-ActinIκB-α/β-ActinNF-κB/β-ActinCK组1.000±0.000Aa1.000±0.000Aa1.000±0.000Aa1.000±0.000Aa1.000±0.000Cd1.000±0.000AaLMS组0.448±0.012Dd0.500±0.007De0.467±0.023Ee0.653±0.018De1.625±0.040Aa0.462±0.035EeTFP 20 mg/L组0.853±0.035Bb0.975±0.014Ab0.857±0.047Bb0.906±0.034Bb1.110±0.049Cc0.718±0.030CcTFP 40 mg/L组0.692±0.045Cc0.800±0.016Cd0.755±0.029Cc0.841±0.019Bc1.270±0.052Bc0.696±0.019CcTFP 80 mg/L组0.481±0.048Dd0.445±0.018Ef0.578±0.037Dd0.493±0.014Ef1.349±0.066Bb0.576±0.030DdTFP 160 mg/L组0.746±0.018Cc0.912±0.011Bc0.695±0.049Cc0.758±0.049Cd1.004±0.078Cd0.847±0.043BbLMS组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组和TFP 160 mg/L组小鼠脾淋巴细胞P-Akt相关蛋白表达极显著低于CK组（P0.01），TFP 20 mg/L组小鼠脾淋巴细胞P-Akt相关蛋白表达显著低于CK组（P＜0.05）；TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞P-Akt相关蛋白表达极显著低于LMS组、TFP 20 mg/mL组、TFP 40 mg/mL组和TFP 160 mg/mL组（P0.01）。TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IKK-α、NF-κB相关蛋白表达极显著高于LMS组（P0.01），极显著低于TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IKK-β相关蛋白表达极显著低于LMS组、TFP 20 mg/L组、TFP 40 mg/L组和TFP 160 mg/L组。LMS组、TFP 40 mg/L组、TFP 80 mg/L组脾淋巴细胞IκB-α相关蛋白表达均极显著高于CK组（P0.01）；TFP 80 mg/L组小鼠脾淋巴细胞IκB-α相关蛋白表达极显著高于TFP 20 mg/L组和TFP 160 mg/L组（P0.01）。3讨论3.1TFP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响脾脏是机体内最大的免疫器官，机体免疫功能与脾淋巴细胞数量密不可分[13]。脾淋巴细胞增殖在免疫应答中具有重要影响，其活性是机体免疫能力的重要指标[14]。王思凝等[15]研究发现，在雏鸡基础日粮中添加大枣多糖能够极显著促进外周血中淋巴细胞的增殖。本研究结果与上述结论一致，表明TFP可激活小鼠脾淋巴细胞，促进脾淋巴细胞的分化和增殖，而发挥免疫调节作用。3.2TFP对小鼠脾淋巴细胞因子分泌及mRNA表达的影响IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ等4种细胞因子在免疫调节或炎症调节中均具有重要作用。IL-6是一种多效性细胞因子，可刺激B细胞增殖、分化并产生抗体[16-17]。IL-10是一种免疫调节细胞因子，在调节炎症中起到关键作用，能够激活自然杀伤（NK）细胞增殖[18-19]。IL-12是IL-12A和IL-12B两条链通过二硫键组成，可激活NK细胞，促进NK细胞增殖[20-21]。IFN-γ在抗病毒、抗肿瘤等方面发挥重要作用[22-23]。乔石等[24]研究发现，太子参参须多糖能够显著提高免疫抑制小鼠血清细胞因子IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。张敬等[25]研究发现，螺旋藻多糖能够减弱脂多糖处理小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的产生，减少氧化应激和抗炎反应。胡惠婷等[26]研究发现，在海兰褐商品代蛋鸡基础日粮中添加苦瓜多糖能够提高血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的含量。本研究结果显示，TFP能够促进脾淋巴细胞IL-6、IL-10、IL-12和IFN-γ的分泌和mRNA的表达，与上述结果一致，表明激活的小鼠脾淋巴细胞可通过分泌细胞因子而发挥免疫调节作用。3.3TFP对小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关蛋白的表达影响PI3K具备丝氨酸/赖氨酸激酶的活性。Akt属于PI3K下游的靶向蛋白[27]。PI3K/Akt信号通路是存在于细胞质中的信号转导通路，是细胞发生自噬的重要调控途径[28]。当被细胞因子和胰岛素等激活后，导致二者结构域构象改变，从而使Akt磷酸化，P-Akt通过调节下游因子，实现调节细胞分化、增殖及凋亡等多种功能[29]。NF-κB在生理状态下是以NF-κBp65/p50二聚体存在的复合物。通常情况下，多与IκB蛋白相结合形成三聚体存在细胞中。当IκB激酶复合物刺激IκB降解，从而释放NF-κBp65/p50，参与炎症反应、细胞凋亡、免疫应答及应激反应[30]。黄秀昆[31]研究发现，老鼠簕生物碱能够抑制肝纤维化大鼠肝组织中NF-κB和PI3K/Akt/Mtor/p70S6K信号通路，并具有一定的干预作用。本研究发现，TFP能够抑制P-PI3K、P-Akt、IKK-α、NF-κB和IKK-β相关蛋白的表达，促进IκB-α相关蛋白的表达，其作用机制可通过激活小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路，发挥免疫调节作用。3.4TFP在畜禽饲料添加剂中的应用张浩等[12]研究发现，利用TFP代替抗生素类产品能够改善仔猪腹泻。TFP作为饲料添加剂来提高畜禽的免疫功能和生产性能未见报道，本研究发现，TFP能够提高小鼠脾淋巴细胞的免疫功能，今后应进一步研究TFP对畜禽免疫功能、生产性能和经济效益的影响，为TFP在畜禽饲料添加剂中的应用提供参考。4结论本研究结果表明，TFP可通过刺激脾淋巴细胞的增殖，促进脾淋巴细胞细胞因子的分泌及其mRNA的表达发挥免疫调节作用，其作用机制是通过激活小鼠脾淋巴细胞PI3K/Akt和NF-κB信号通路，发挥免疫调节作用，TFP为80 mg/L时效果较好。