随着生活水平提高，人们对食品的质量要求也越来越高。鸡肉是重要的肉品来源，由于饲粮中抗生素的使用，使鸡肉中药物残留问题愈发受到关注，因而亟须寻找绿色、安全、高效的添加剂替代抗生素。益生菌是定居于体内的能够使宿主受益的微生物[1]。益生菌应用于动物饲料中不会产生耐药菌，也不会产生药物残留，是一类有效的替抗产品，在动物生产中具有积极作用[2]。益生菌进入体内后能够在肠道中定植[3]，增加有益菌的含量，有效调节肠道微生态平衡[4]，促进肠道消化酶的分泌，增强消化酶活性[5]，提高肠绒隐比[6]，改善机体对营养物质的吸收，进而提高动物的生产性能[7]。肠道炎症是一种常见的多发疾病[8]，肠道菌群的紊乱可诱导肠道炎症，严重降低家禽的生长性能和养殖的经济效益。多项研究发现，在肉鸡饲粮中添加益生菌能够有效提高免疫功能[9-10]。本试验探究复合益生菌对肉鸡生长性能、血清免疫指标、肠道结构及微生物的影响，以期为复合益生菌在肉鸡饲粮中的合理添加提供参考。1材料与方法1.1试验材料本试验使用的复合益生菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌等，活菌总数3×109 CFU/g，购自山东微尔生物工程有限公司。1.2试验设计与饲养管理选择体况相近、公母各半的1日龄爱拔益加肉鸡1 440只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复60只肉鸡。对照组试验肉鸡饲喂基础日粮（即CON组），各试验组分别在基础日粮中添加500（CP1组）、1 000（CP2组）、2 000 g/t复合益生菌（CP3组）。基础日粮为玉米-豆粕型日粮，参考照《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004），其原料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成/%1~21 d22~42 d营养水平1~21 d22~42 d合计100.00100.00玉米57.8463.00代谢能/(MJ/kg)11.9512.57大豆粉24.5021.84粗蛋白质/%21.8419.91玉米蛋白粉6.333.74钙/%0.960.85鱼粉4.004.00总磷/%0.760.69鱼油2.372.69有效磷0.460.45氯化钠0.250.24赖氨酸/%1.031.00DL-蛋氨酸0.080.15蛋氨酸+半胱氨酸/%0.880.73L-赖氨酸0.030.04色氨酸/%0.820.78苏氨酸0.020石粉1.281.06磷酸二氢钙1.301.24预混料2.002.00注：1.预混料为每千克生长前期日粮提供：VA 7 800 IU、VD3 1 000 IU、VE 30 mg、VK 31.5 mg、VB1 2.0 mg、VB2 7.5 mg、VB6 4.5 mg、VB12 0.01 mg、泛酸17 mg、烟酸36 mg、叶酸0.57 mg、生物素0.20 mg、氯化胆碱1 200 mg、Cu 7 mg、Fe 85 mg、Zn 82 mg、Mn 80 mg、I 0.7 mg。2.预混料为每千克生长后期日料提供：VA 6 200 IU、VD3 780 IU、VE 15mg、VK3 0.8 mg、VB1 2.0 mg、VB2 4 mg、VB6 2.8 mg、VB12 0.01 mg、泛酸8.5 mg、烟酸27 mg、叶酸0.65 mg、生物素0.18 mg、氯化胆碱1 100 mg、Cu 6.3 mg、Fe 62 mg、Zn 61 mg、Mn 62 mg、I 0.54 mg。3.营养水平中粗蛋白质、钙、磷为实测值，其余均为计算值。肉鸡采用笼养模式，试验共42 d。第1周环境温度控制在32~34 ℃，第2周后逐步降温，至第4周环境温度控制在27~28 ℃。试验前期相对湿度控制在70%~80%，后期相对湿度控制在65%~75%。免疫程序按照常规养殖标准进行，饲养由专人负责。肉鸡自由采食和饮水。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验开始及试验第21、42 d，以重复为单位对所有试验肉鸡空腹称重，记为初重和不同试验阶段的末重，及时记录每天的投料量和余料量，计算平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)平均日采食量=(投料量-余料量)/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2免疫指标各阶段试验结束时，每组选12只肉鸡翅静脉采血5 mL，血液凝固后于2~8 ℃条件下3 000 r/min离心15 min，取上清液于2 mL无菌无酶EP管中，-80 ℃冰箱保存，用于检测血清免疫指标。血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）的含量使用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定。肉鸡采血后处死，采集脾脏、胸腺和法氏囊，剔除表面结缔组织，并用滤纸吸干脏器表面的血水后称重，计算免疫器官指数[11]。免疫器官指数=免疫器官鲜重/活重(4)1.3.3肠道微生物及肠道形态结构检测各阶段试验结束时，各处理组随机处死6只鸡，无菌采集盲肠内容物用于检测大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量，菌落数用每克盲肠内容物所含细菌菌落总数的对数表示（lgCFU/g）[12]。分别采集1 cm长的十二指肠、空肠和回肠，10%多聚甲醛固定，用于检测肠道形态结构。将包埋后的肠段切片（厚度6 μm）后HE染色，电镜扫描，扫描图像使用caseViewer软件测量不同肠段的绒毛高度（VH）、隐窝深度（CD），计算绒隐比（V/C）。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步整理，SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，方差分析结果显著时采用Bonferroni法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”显示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合益生菌对肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，1~21日龄，与CON组相比，CP2组和CP3组肉鸡末重极显著升高（P0.01），各试验组肉鸡平均日增重极显著升高（P0.01）。CP2组、CP3组肉鸡料重比极显著低于CON组（P0.01），CP3组极显著低于CP1组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T002表2复合益生菌对肉鸡生长性能的影响项目CON组CP1组CP2组CP3组1~21日龄1日龄重/(g/只)44.98±3.6445.06±3.4945.12±3.5745.06±3.6721日龄重/(g/只)882.37±25.03C902.31±25.16BC949.36±25.20AB983.64±24.98A平均日增重/[g/(只·d)]39.86±0.32D40.82±0.34C43.06±0.36B44.69±0.31A平均日采食量/[g/(只·d)]55.63±0.5756.34±0.5955.98±0.5956.49±0.51料重比1.40±0.05A1.38±0.04AB1.30±0.03BC1.26±0.03C22~42日龄42日龄重/(g/只)2 318.54±46.34C2 458.19±45.98B2 552.85±46.49A2 601.29±47.00A平均日增重/[g/(只·d)]68.39±0.58C74.09±0.51B76.36±0.53A77.03±0.59A平均日采食量/[g/(只·d)]140.35±0.26141.03±0.21142.06±0.19141.26±0.28料重比2.05±0.07A1.90±0.05B1.86±0.06B1.83±0.06B1~42日龄平均日增重/[g/(只·d)]54.13±0.73C57.46±0.72B59.71±0.79A60.86±0.81A平均日采食量/[g/(只·d)]97.99±0.2498.69±0.2599.02±0.2698.875±0.21料重比1.81±0.05A1.72±0.06AB1.66±0.04BC1.62±0.05C注：同行数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4、表6与此同。22~42日龄，各试验组肉鸡的末重及平均日增重极显著高于CON组（P0.01），CP2组、CP3组极显著高于CP1组（P0.01），各试验组肉鸡的料重比极显著低于CON组（P0.01）。1~42日龄，CP2组、CP3组肉鸡平均日增重极显著高于CP1组和CON组（P0.01），CP1组极显著高于CON组（P0.01）。CP2组、CP3组肉鸡料重比极显著低于CON组（P0.01）。2.2复合益生菌对肉鸡免疫指标的影响（见表3、表4）由表3可知，21日龄时，CP2组、CP3组肉鸡的脾脏指数极显著高于CON组（P0.01），CP3组极显著高于其他添加组（P0.01）；各组肉鸡胸腺指数随着复合益生菌添加量增加而极显著升高（P0.01）；各试验组肉鸡法氏囊指数极显著高于CON组（P0.01），CP2组、CP3组极显著高于CP1组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T003表3复合益生菌对肉鸡免疫器官指数的影响组别21日龄42日龄脾脏指数胸腺指数法氏囊指数脾脏指数胸腺指数法氏囊指数CON组0.71±0.02C1.12±0.02D1.73±0.01C0.93±0.05C2.24±0.06C0.62±0.05CCP1组0.76±0.03BC1.34±0.03C1.82±0.03B1.06±0.03B2.36±0.04BC0.73±0.06BCCP2组0.81±0.04B1.42±0.01B1.96±0.04A1.24±0.02A2.41±0.05B0.81±0.03ABCP3组0.90±0.03A1.53±0.04A2.01±0.02A1.32±0.06A2.59±0.07A0.92±0.07A注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5与此同。g/kg42日龄时，CP2组和CP3组肉鸡的脾脏指数和胸腺指数极显著高于CON组（P0.01）；CP3组肉鸡法氏囊指数极显著高于CON组和CP1组（P0.01）。由表4可知，21日龄时，各试验组肉鸡血清IgA含量极显著高于CON组（P0.01）；CP3组肉鸡血清IgM含量极显著高于CON组、CP1组、CP2组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T004表4复合益生菌对肉鸡血清免疫指标的影响项目CON组CP1组CP2组CP3组21日龄IgA/(g/L)1.00±0.08B1.20±0.07A1.29±0.06A1.31±0.07AIgM/(g/L)0.80±0.06C0.86±0.05BC0.94±0.07B1.16±0.06AIgG/(g/L)8.70±0.899.12±0.849.34±0.799.42±0.82IL-2/(ng/L)325.53±5.34326.37±6.24328.27±5.29330.57±6.38IL-6/(ng/L)150.37±9.25156.38±8.34162.53±10.27168.43±9.5642日龄IgA/(g/L)0.90±0.03D0.98±0.02C1.15±0.04B1.27±0.03AIgM/(g/L)0.95±0.04C1.16±0.03B1.25±0.06AB1.32±0.05AIgG/(g/L)8.50±0.648.95±0.599.25±0.619.34±0.58IL-2/(ng/L)328.34±6.54329.56±5.59331.36±6.64335.33±6.59IL-6/(ng/L)162.34±11.23155.38±9.63158.53±11.37160.53±8.9742日龄时，各试验组肉鸡血清IgA含量随着复合益生菌添加量增加呈极显著升高（P0.01），CP3组肉鸡血清IgM含量极显著高于CON组和CP1组（P0.01）。2.3复合益生菌对肉鸡肠道微生物及形态结构的影响（见表5、表6）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T007项目CON组CP1组CP2组CP3组回肠21 dV/μm342.08±15.23B352.34±16.98B396.81±17.03A413.92±15.67AC/μm76.23±15.2372.42±14.6964.03±15.0259.46±16.24V/C4.49±1.02b4.87±1.23ab6.2±1.18ab6.96±1.21a42 dV/μm444.7±58.69b458.05±57.36b515.86±56.89ab538.09±58.02aC/μm73.18±17.2869.52±16.8961.47±15.6757.08±16.49V/C6.08±1.35b6.59±1.26b8.39±1.54ab9.43±1.37a由表5可知，21日龄时，CP2和CP3组肉鸡大肠杆菌数量极显著低于CON组（P0.01），CP3组肉鸡盲肠乳酸杆菌数量极显著高于CON组（P0.01）。42日龄时，CP3组肉鸡盲肠大肠杆菌数量显著低于CON组（P0.05），盲肠乳酸杆菌数量极显著高于CON组（P0.01），双歧杆菌数量及乳酸杆菌与大肠杆菌的比值显著高于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T005表5复合益生菌对肉鸡肠道微生物的影响组别21日龄42日龄大肠杆菌乳酸杆菌双歧杆菌乳酸杆菌/大肠杆菌大肠杆菌乳酸杆菌双歧杆菌乳酸杆菌/大肠杆菌CON组6.25±0.24A7.59±0.24B8.42±0.321.21±0.246.34±0.52a8.23±0.35B8.92±0.31b1.30±0.23bCP1组6.08±0.31AB7.92±0.31AB8.51±0.421.30±0.315.84±0.48ab8.62±0.41AB9.15±0.26ab1.48±0.24abCP2组5.61±0.26BC8.12±0.26AB8.59±0.391.45±0.285.42±0.51ab9.12±0.54AB9.37±0.25ab1.68±0.19abCP3组5.42±0.19C8.34±0.27A8.61±0.431.54±0.265.34±0.49b9.34±0.37A9.48±0.27a1.75±0.26algCFU/g由表6可知，21、42 d时，CP2组、CP3组肉鸡十二指肠V值极显著高于CON组（P0.01），CP3组肉鸡十二指肠V/C显著高于CON组（P0.05）。21 d时，CP3组肉鸡空肠V值显著高于CON组（P0.05），V/C极显著高于CON组（P0.01）；42 d时，CP3组肉鸡空肠V值极显著高于CON组和CP1组（P0.01），V/C显著高于CON组（P0.05）。21 d时，CP2组、CP3组肉鸡回肠V值极显著高于CON组和CP1组（P0.01），V/C显著高于CON组（P0.05）；42 d时，CP3组肉鸡回肠V值和V/C显著高于CON组和CP1组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.010.T006表6复合益生菌对肉鸡肠道形态结构的影响项目CON组CP1组CP2组CP3组十二指肠21 dV/μm634.25±48.52B692.34±45.32AB746.38±46.27A762.18±43.12AC/μm142.03±11.49a135.23±12.17ab128.64±9.58ab121.03±11.10bV/C4.47±1.08b5.12±0.91ab5.80±1.02ab6.30±1.13a42 dV/μm716.7±52.12B782.34±51.23AB843.31±53.18A861.26±54.03AC/μm136.35±18.34129.82±18.37123.49±19.23116.19±17.37V/C5.26±1.23b6.03±1.25ab6.83±1.38ab7.41±1.37a空肠21 dV/μm458.23±62.34b471.98±65.23b526.96±60.27ab554.46±58.34aC/μm138.54±20.34127.46±21.38117.76±19.34113.6±20.15V/C3.31±0.48C3.70±0.56BC4.47±0.67AB4.88±0.54A42 dV/μm595.7±58.36B613.57±51.03B685.05±49.23AB720.80±53.07AC/μm128.29±25.36118.02±26.48109.04±26.37105.20±24.38V/C4.64±1.03b5.20±1.34ab6.28±1.25ab6.85±1.17a续表6　复合益生菌对肉鸡肠道形态结构的影响3讨论3.1复合益生菌对肉鸡生长性能的影响研究表明，在饲粮中添加益生菌能够有效提高家禽的平均日增重，降低料重比[13-14]。本研究同样发现，添加复合益生菌能够极显著提高AA肉鸡的平均日增重。连丽娜等[7]研究发现，在基础饲粮中添加5 g/kg的复合益生菌能够有提高黄羽肉鸡的平均日增重。谢文惠等[15]研究发现，在AA肉鸡饲粮中添加1 000 mg/kg复合益生菌后肉鸡的平均日增重、料重比均得到有效改善。郭王勇等[16]在罗斯308肉鸡饮水中添加复合益生菌后显著提高了平均日增重，降低了料重比。上述研究结果与本研究结论类似，原因可能是益生菌在消化道代谢产生的氨基酸等产物加强了肠道屏障，阻碍了病原微生物的定植，维持了肠道微生态的稳态，促进了营养物质的消化吸收，提高了生长性能[13,17]。不同生长阶段的鸡对益生菌的利用程度存在差异[18]。某些益生菌（如芽孢杆菌）自身能够产生一些营养物质且具备某些酶（如淀粉酶和蛋白酶）的活性，从而提高肉鸡的生长性能[19]。3.2复合益生菌对肉鸡免疫功能的影响家禽的胸腺、脾脏和法氏囊是家禽体内重要的免疫器官，其质量直接影响机体的免疫力[20]。研究表明，饲喂复合益生菌能够有效提高肉鸡的免疫器官指数和血清免疫球蛋白含量[21]。王兴勇等[22]研究发现，在AA肉鸡饮水中添加复合益生菌后显著提高了肉鸡脾脏指数和法氏囊指数。高新磊等[23]研究发现，在鸡舍中喷洒复合益生菌喷雾剂显著提高了科宝肉鸡的胸腺和法氏囊指数。上述研究结果与本研究结论一致，原因可能是益生菌进入体内后能够刺激肉鸡免疫细胞增殖[24]。本研究发现，日粮添加2 000 g/t复合益生菌显著提高了肉鸡血清IgM、IgA含量。Zhang等[25]研究表明，添加复合益生菌饲喂后显著提高了肉鸡血清IgA、IgM的含量。刘凤美等[26]发现，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合益生菌显著提高了血清IgG的含量。原因可能是复合益生菌联合使用后不同的益生菌激活浆细胞产生不同的血清免疫球蛋白[27]。某些益生菌能够在体内将物质代谢转化为杀菌物质（如有机酸、H2O2和杀菌素）也能提高机体的免疫能力[28]。3.3复合益生菌对肉鸡肠道微生物及肠道形态结构的影响畜禽的肠道微生态是否平衡直接关系机体健康[29]。研究表明，益生菌能够显著提高肉鸡盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，降低大肠杆菌的数量[30]。本研究发现，饲粮中添加2 000 g/t的复合益生菌能够极显著提高乳酸杆菌和双歧杆菌的含量，极显著降低大肠杆菌的数量。谢文惠[31]研究发现，在肉鸡饲粮中添加1 000 mg/kg的复合益生菌能够显著降低大肠杆菌数量，显著提高乳酸杆菌数量。张利环等[32]发现，黄麻肉鸡饲用含复合益生菌的饲粮后盲肠中的乳酸菌丰度显著增加。上述研究结果与本研究结论一致，但添加量不同，原因可能是不同厂家的复合益生菌的种类及含量不同。肠道是营养物质吸收的关键部位，肠道绒毛高度决定营养物质吸收的效率，隐窝深度表示肠道细胞的充盈及成熟数量，隐窝越浅表明肠细胞增殖活性越高，分泌能力越强[33]。绒隐比能够反映肠道消化吸收能力的强弱，绒隐比越低肠道对营养物质的消化和吸收的能力越强。本研究结果发现，在饲粮中添加复合益生菌能够提高绒毛高度和绒隐比。刘亭婷等[34]报道，添加1 g/kg的丁酸梭菌可使肉鸡小肠各段的绒毛高度和绒隐比显著升高。孟小林等[9]研究发现，饲喂0.2%和0.3%的复合益生菌后显著提高了AA肉鸡十二指肠的绒毛高度和绒隐比。上述研究结果与本研究结论一致。复合益生菌可能通过提高肠黏膜的连接蛋白含量，保护肠道免受损害，维持肠道平衡状态，为营养物质的吸收提供了有力保障[35]。4结论本研究发现，在饲粮中添加不同含量的复合益生菌能够有效提高AA肉鸡的生长性能、免疫功能，提高盲肠内有益菌的数量，降低有害菌的数量，提高肠道绒毛高度和绒隐比，且适宜添加量为2 000 g/t。