禽白血病病毒（avian leukosis viruses，ALV）是引起禽类各种造血细胞肿瘤性增生的一类C型逆转录病毒，根据病毒传播方式不同分为内源性病毒（E亚群）和外源性病毒[1-2]。外源性ALV中ALV-J致病性最强，而禽内源性白血病毒（ALV-E）致病性很低或无致病性。ALV-E最早在鸡中发现，遵循孟德尔遗传规律垂直传播，几乎所有正常鸡基因组中均携带完整或缺陷性的ALV-E基因[3]。Fulton等[4]对ALV-E整合与蛋肉鸡生产性能进行关联分析，发现ev3对某品系来航鸡的产蛋量、穿刺评分、马立克氏病抗性等均具有正面影响，而在其他品系中则对蛋重、蛋壳颜色、蛋白高度等产生了负面影响。宁中华等[5]发现，慢羽鸡白血病发病率比快羽鸡高。慢羽白莱航鸡及其后代均表现出对外源淋巴白血病病毒免疫性能减退、生产性能下降、死亡率升高等症状，这些症状可能均与ev21有关[5-6]。在家禽基因组中，若宿主携带ev21或ev6则比非携带者更易受到外源性ALV-J的影响，更易发生肿瘤[7]。携带TVB*S1（易感B、D、E亚群）基因的鸡整合ev3、ev6或ev9时，ev位点的表达会与TVB*S1受体基因结合从而阻断外源或其他内源病毒的感染[8]。Mason等[9]通过obsERVer技术发现ALV-E具有很高的多样性，可能参与ERV衍生免疫。高水平的维生素D和低水平的EB病毒导致人内源性白血病病毒（HERV）的表达降低，从而降低多发性硬化症（MS）发生[10]。因此提高维生素D的水平可降低HERV的表达。Liu等[11]发现，禁食和过量喂养可通过ALV-E影响鹅肝脏中免疫或炎症相关基因的表达，推测营养调控可能通过DNA甲基化调节ALV-E的表达。研究发现，在相同饲养管理条件下，快羽系与慢羽系太行鸡在体重、抗病力、产蛋性能等性状存在一定区别[12-13]。近年来，国内有关ev3、ev6、ev21整合对鸡免疫性能的影响的研究报告较少。本试验以1日龄太行和大午雏鸡为研究对象，研究内源性ALV ev3、ev6、ev21整合对鸡体重、免疫器官指数以及血液免疫球蛋白和细胞因子含量的影响，以期为河北地方鸡的选育及合理利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物1日龄太行雏鸡112只，其中公鸡66只，母鸡46只；大午雏鸡106只，其中公鸡60只，母鸡46只，体重为30~40 g，购自河北某种鸡场。1.1.2试验试剂Easy pure血液DNA提取试剂盒购自北京全式金生物有限公司；鸡血清免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；2×Taq MasterMix购自康为世纪生物科技有限公司，引物合成由金唯智生物科技有限公司完成。鸡羽型、ev21、ev3和ev6整合检测的引物信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.T001表1鸡羽型和ev21、ev3、ev6鉴定引物引物名称引物序列退火温度/℃产物长度/bpdPRLR-SPEF2-F5'-CCTCCTTGCCAAACCTTA-3'601 305dPRLR-SPEF2-R5'-ATCAGCCAGATCCGTCAG-3'GHR-F5'-ACTTACTGCCAGGGTGTTGT-3'60857GHR-R5'-AAACTGCTACTCCGCTACTG-3'ev21F5'-AGCCAGAGGCAACTTGAATA-3'681 440ev21R5'-CTGCTCCATACGGTACACACCA-3'ev3D5'-CTTCTCCAGCTTCAGTGACGC-3'65~56270/190ev3U5'-GAAATGCCTGCCCCATGCCAGTG-3'LTR5'-CCTGAATGAAGCAGAAGGCTTC-3'ev6D5'-CACAGCCCTATGTGGCACTTCAAGG-3'66~60300LTR5'-CCTGAATGAAGCAGAAGGCTTC-3'1.2试验方法1.2.1鸡血液DNA提取采用苯酚-氯仿粗提法提取待测定鸡血液基因组，浓度在200~400 mg/L，统一稀释至50 mg/L，-20 ℃储存。1.2.2雏鸡羽型和ev21整合检测参考Zhang等[14]的双重灰度PCR方法合成引物dPRLR-SPEF2-F/R和GHR-F/R检测羽型，参考张乐超[15]对鸡内源病毒ev21检测的方法合成引物ev21F和ev21R。1.2.3雏鸡ev3、ev6整合的检测根据Benkel[16]研究方法合成4条引物进行PCR反应明确ev3、ev6的整合性。PCR扩增体系（总体积为10 μL）：MIX 5 μL、上下游引物各0.2 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 4.1 μL。PCR扩增程序：ev3设4个梯度，每个梯度退火温度降3 ℃，由65 ℃降至56 ℃；每个循环95 ℃变性30 s，72 ℃延伸13 s；最后一个梯度28循环，其他2个循环。ev6设3个梯度，每个梯度退火温度降3 ℃，由66 ℃降至60 ℃；每个循环95 ℃变性30 s，72 ℃延伸18 s；最后一个梯度循环30次，其他循环2次。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.2.4雏鸡免疫器官指数雏鸡称重后解剖采集脾脏、法氏囊和左侧胸腺并称重，计算免疫器官总重及脏器指数。免疫器官总重=脾脏重+法氏囊重+左侧胸腺重(1)免疫器官指数=(器官重量/雏鸡体重)×1 000‰(2)1.2.5雏鸡血清IgG、IgA、IgM、IL-4和IL-10含量采集雏鸡心脏血液，室温血液自然凝固20 min，3 000 r/min离心15~20 min，析出血清，参考酶联免疫试剂盒说明书检测IgG、IgA、IgM、IL-4和IL-10含量。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2020进行初步整理，SPSS 25.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较；χ2检验ev3和ev6在太行鸡和大午金凤鸡中的整合差异性。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1两品种鸡的羽型和ev21整合分布检测发现，112只太行鸡中84只为快羽，28只为慢羽，100只为ev21阴性，12只为ev21阳性。106只大午金凤鸡有46只ev21阴性快羽母鸡，60只为ev21阳性慢羽公鸡。2.2两品种鸡的ev3和ev6整合率（见图1、表2）由图1（a）可知，泳道1、2和6有一条270 bp条带，表明其对应个体无ev3整合；泳道3有190 bp条带，表明对应个体有ev3整合，泳道4和5有270 bp和190 bp两条条带，表明其对应个体为ev3整合杂合。由图1（b）可知，泳道1、2、4、6、7仅有300 bp一条带，表明其对应个体为ev6阳性；泳道3和5无条带，表明其对应个体为ev6整合阴性。图1ev3和ev6整合性的凝胶检测10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.F1a1（a）ev3注：M为DL5000 DNA Marker，1、2、6为ev3阴性，3为ev3阳性，4-5为ev3杂合个体。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.F1a2（b）ev6注：M为DL5000 DNA Marker，1、2、4、6、7为ev6阳性，3、5为ev6阴性。由表2可知，112只太行鸡中18只为ev3阳性，94只为ev3阴性；4只为ev6阳性，108只为ev6阴性，阳性率分别为16.07%和4.08%。106只大午金凤鸡6只为ev3阳性，100只为ev3阴性，阳性率为5.66%；ev6全部为阴性。太行鸡和大午金凤鸡的ev3和ev6阳性率均较低，但ev3在太行鸡的整合阳性率显著高于大午金凤鸡（P0.05），ev6整合在两品种间差异不显著（P0.05），平均为2.83%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.T002表2ev3和ev6在太行鸡和大午金凤鸡中的分布品种总数/只ev3ev6阳性数/只阴性数/只阳性率/%阳性数/只阴性数/只阳性率/%太行鸡112189416.07a41085.66大午金凤鸡10661004.08b01060注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3太行鸡和大午金凤鸡的免疫器官指数（见表3）对112只1日龄太行鸡称重及免疫器官采集后，只有94只个体样品完好且一一对应，对94只1日龄太行鸡和106只1日龄大午金凤鸡免疫器官指数进行统计分析，结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.T003表3太行鸡和大午金凤鸡的免疫器官指数品种类别个体数/只体重/g胸腺指数/‰脾脏指数/‰法氏囊指数/‰免疫器官总重/g太行鸡ev3阳性1629.55±0.22b1.70±0.021.03±0.021.44±0.01a0.12±0.01阴性7831.82±0.36a1.60±0.010.76±0.011.05±0.01b0.11±0.00ev6阳性433.39±1.862.11±0.010.77±0.011.08±0.020.13±0.01阴性9031.34±0.301.60±0.010.80±0.011.12±0.010.11±0.00ev21阳性829.47±0.79b1.42±0.020.75±0.011.11±0.010.10±0.01阴性8631.61±0.31a1.63±0.010.81±0.011.12±0.010.11±0.00羽型快羽7231.61±0.351.64±0.010.82±0.011.13±0.010.11±0.00慢羽2230.83±0.531.56±0.020.75±0.011.08±0.010.10±0.01性别公鸡5830.90±0.37b1.52±0.010.74±0.011.12±0.010.10±0.01b母鸡3632.29±0.46a1.77±0.010.92±0.011.12±0.010.12±0.01aev21与羽型阳性慢羽829.47±0.791.42±0.020.76±0.011.11±0.010.10±0.01阴性慢羽1431.60±0.621.63±0.020.76±0.021.06±0.020.11±0.01阴性快羽7231.61±0.351.64±0.010.82±0.011.13±0.010.11±0.00大午金凤鸡ev3阳性638.86±3.070.82±0.010.20±0.000.67±0.010.06±0.01阴性10038.20±0.330.99±0.010.21±0.000.62±0.000.07±0.00ev21阴性快羽母鸡4637.85±0.440.97±0.010.20±0.000.55±0.000.06±0.00ev21阳性慢羽公鸡6038.54±0.530.99±0.010.21±0.000.67±0.000.07±0.00注：同列同项目数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。由表3可知，ev3整合阳性太行鸡的法氏囊指数显著高于阴性个体（P0.05），体重显著低于阴性个体（P0.05）。而大午金凤鸡的体重和免疫器官指数并未表现由于ev3整合的明显或趋势性变化，可能与大午金凤鸡ev3阳性个体数太少有关。此外，没有发现ev6对太行和大午金凤鸡免疫器官指数和体重的影响，原因可能是ev6阳性个体太少。由于ev21整合在鸡Z染色体上并与鸡的羽型存在一定程度的连锁关系，本试验检测了所有样品的羽型。ev21阴性太行鸡体重显著高于阳性鸡（P0.05）。快羽太行鸡体重和5个免疫器官指标均高于慢羽，但差异不显著（P0.05）；母鸡体重和免疫器官总重显著高于公鸡（P0.05）。此外，ev21阴性快羽太行鸡的体重和各免疫器官指标均高于ev21阴性慢羽太行鸡和ev21阳性慢羽鸡，但差异不显著（P0.05）。大午金凤鸡以羽型作为配套系生产中性别鉴定的依据，ev21整合与性别和羽型紧密连锁，试验样品为大午金凤商品系，分为ev21阴性快羽母鸡和ev21阳性慢羽公鸡两类。由表3可知，ev21阳性慢羽公鸡的体重和各免疫器官指标均高于ev21阴性快羽母鸡，但差异不显著（P0.05），与ev21对太行鸡可能的影响表现完全相反。2.4太行鸡和大午金凤鸡的血清免疫指标检测结果利用ELISA试剂盒说明书检测标准品，得到血清IgG、IgM、IgA、IL-4和IL-10蛋白浓度（y）与吸光度值（x）的标准曲线（见图2），回归方程分别为y=1.346 6x-0.014 6（R²=0.999 3）、y=0.439 3x+0.009 5（R²=0.998 8）、y=154.69x-13.712（R²=0.990 4）、y=124.41x-4.378 8（R²=0.986 9）和y=46.353x-1.182 8（R²=0.993 1）。IL-4的决定系数接近99.0%，其他全部高于99.0%，符合要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.F002图2血清标准品浓度与OD值的曲线拟合由于采集时间和储存条件的差异，106份大午金凤鸡血清中分离得到53份血清符合条件。112只太行鸡和53只大午金凤鸡血清IgG、IgM、IgA、IL-4和IL-10检测结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.012.T004表4太行鸡和大午金凤鸡血清IgG、IgM、IgA、IL-4和IL-10检测结果品种类别个数/只IgG/(g/L)IgM//(g/L)IgA/(mg/L)IL-4/(ng/L)IL-10/(ng/L)太行鸡ev3阳性184.43±0.29a0.84±0.02275.02±7.64160.85±4.58a68.71±1.49阴性943.81±0.91b0.81±0.02283.46±2.93149.71±2.10b68.49±0.71ev6阳性4——284.52±11.39149.17±5.7561.30±2.27b阴性108282.01±2.83151.59±2.0068.80±0.65aev21阳性124.09±0.130.79±0.01275.24±4.80148.03±3.0667.05±1.36阴性1003.82±0.100.82±0.02282.93±3.02151.92±2.1468.71±0.70羽型快羽843.61±0.19b0.81±0.01280.65±3.31150.65±2.2468.12±0.78慢羽284.05±0.08a0.82±0.02286.45±4.75154.06±3.9069.74±1.05性别公鸡663.72±0.17b0.79±0.02284.63±3.72150.45±2.3567.82±0.79母鸡464.06±0.06a0.83±0.02278.48±4.04153.00±3.3369.54±1.07ev21与羽型阳性慢羽124.09±0.13a0.79±0.01275.24±4.80148.03±3.0667.05±1.36阴性慢羽164.00±0.09a0.84±0.04294.86±6.89158.58±6.2871.76±1.34阴性快羽843.61±0.19b0.81±0.01280.65±3.31150.65±2.2468.12±0.78大午金凤ev3阳性32.12±0.150.85±0.07b296.51±8.14183.38±4.5977.25±2.36阴性502.21±0.031.08±0.02a290.00±3.57179.18±3.8277.54±0.82ev21阴性快羽母鸡232.20±0.051.05±0.04290.84±6.21169.96±6.46b78.97±1.15ev21阳性慢羽公鸡302.21±0.041.09±0.03291.61±3.97186.73±2.63a76.49±1.06注：“—”表示无相关数据。由表4可知，ev3阳性太行鸡血清IgG和IL-4含量显著高于ev3阴性鸡（P0.05）。ev6阳性太行鸡血清IL-10含量显著低于ev6阴性鸡（P0.05）。ev21阳性太行鸡血清IgM、IgA、IL-4和IL-10含量分别较ev21阴性鸡降低3.7%、2.7%、2.6%、2.4%，IgG含量提高7.1%，但差异均不显著（P0.05）。ev3阳性大午金凤鸡血清IgM含量显著低于ev3阴性鸡（P0.05）。ev21阳性慢羽大午金凤公鸡血清IL-4含量显著高于ev21阴性快羽母鸡（P0.05）。此外，太行慢羽鸡5个血清指标均高于快羽鸡，母鸡的血清指标除IgA外均高于公鸡，且慢羽鸡和母鸡的血清IgG含量显著高于快羽鸡和公鸡（P0.05）。ev21阴性太行快羽鸡血清IgG含量显著低于ev21阴性太行慢羽鸡和ev21阳性太行慢羽鸡（P0.05），其他4个血清指标均表现为ev21阴性慢羽鸡ev21阴性快羽鸡ev21阳性慢羽鸡，但三者间差异不显著（P0.05）。结果表明，ev3整合提高了太行雏鸡血清IgG和IL-4含量，降低了大午金凤雏鸡IgM含量；ev6整合降低了太行雏鸡血清IL-10含量；ev21整合提高了大午金凤鸡血清IL-4含量；太行慢羽鸡和母鸡血清IgG含量分别高于快羽鸡和公鸡。3讨论3.1ev3、ev6、ev21在太行鸡和大午金凤雏鸡体内的分布Smith等[17]研究发现，ev21的存在会延迟鸡体内免疫防疫系统对ALV做出免疫应答反应，使ALV的致病性增加。且不同羽型和性别的鸡免疫功能也存在一定差异，慢羽白来航雏鸡及其后代死亡率高，与其慢羽母鸡携带者其后代ev21阳性率高有关[18-19]。此外，内源性白血病病毒间存在一定的交互作用，当ev3或ev6存在时可阻断外源病毒附着从而提高机体免疫水平[20]。本试验结果显示，大午金凤鸡慢羽与ev21紧密联系，ev3在太行鸡的整合阳性率显著高于大午金凤鸡，ev6整合在两品种间无差异，表明大午金凤鸡品种稳定性更强，选择强度高。3.2ev3、ev6、ev21对太行鸡和大午金凤雏鸡血清免疫指标的影响胸腺、脾脏和法氏囊是禽类的重要免疫器官。免疫球蛋白是机体防止病原微生物的入侵重要免疫屏障，IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，可通过其水平变化反映动物机体的体液免疫。IgM是抗原刺激诱导体液免疫应答中最先释放的免疫球蛋白，可在早期免疫防御中发挥重要作用[21]。血清型IgA具有IgG和IgM的某些免疫功能[22]。IL-4和IL-10是重要的免疫细胞因子，可调节免疫球蛋白E（IgE）含量[23]。因此，IgG、IgM和IgA以及IL-4、IL-10含量体现了机体免疫能力。本试验发现，ev3阳性太行鸡免疫器官指数和免疫器官总重均高于ev3阴性鸡，且ev3阳性太行鸡血清IgG和IL-4含量显著高于ev3阴性鸡。结果表明，ev3整合在一定程度上提高了太行鸡的免疫性能，但ev3对大午金凤鸡的影响还需要进一步试验验证。本试验中，ev6对鸡免疫器官指数无明显影响，但ev6阳性太行鸡血清IL-10含量显著低于ev6阴性鸡，与Smith等[24]发现，ev6可能对机体免疫反应产生普遍的负面影响的结果一致。ev21阳性太行鸡体重显著低于阴性，除IgG含量高于阴性外其他血清免疫指标均低于阴性，与冯艳苓等[25]的结论一致。大午金凤ev21阳性慢羽公鸡的体重和免疫器官指数均高于ev21阴性快羽母鸡，血清IL-4含量显著高于ev21阴性快羽公鸡。王建俊[26]研究发现，0.5、1.0、2.0 mg/kg砷制剂对禽白血病患病鸡体重下降情况具有缓解作用。3.3ev21与性别羽型对太行雏鸡免疫指标的影响Khosravinia[27]研究发现，快羽雌性的体重、胴体重、等方面均高于其他基因型。Sikur等[28]发现，饲养中112 d前快羽鸡比慢羽鸡重。Harris等[18]发现，慢羽鸡内源性ALV水平传播倾向更大，抗体反应受损，后代产蛋率低。慢羽鸡血清IgG和IgM含量始终高于快羽鸡，且快羽鸡易感ALV-J[29]。本试验结果显示，太行快羽鸡、母鸡体重与免疫器官指数高于慢羽鸡、公鸡，与冯艳苓等[25]慢羽鸡体重和免疫性能高于快羽鸡的研究结果不一致，但太行慢羽鸡、母鸡血清IgG含量显著高于快羽、公鸡。慢羽鸡血清其他免疫指标含量高于快羽鸡，但差异不显著，与冯艳苓等[25]研究结果一致，与郭欣[12]和谭艳[30]报道的结果不同。在太行鸡中，ev21阳性慢羽鸡体重和免疫器官指数低于ev21阴性慢羽和ev21阴性快羽鸡，与预期结果一致，与冯艳苓等[25]研究结果不一致。ev21阴性快羽鸡IgG含量显著低于ev21阴性慢羽和ev21阳性慢羽鸡，与冯艳苓等[25]研究结果一致。ev21阳性慢羽鸡其他血清免疫指标低于ev21阴性快羽鸡和ev21阴性慢羽鸡，但差异不显著。孙文悦[31]发现，在鸡饲粮中添加海藻多糖能够明显促进鸡脾脏、法氏囊的发育。大枣多糖[32]和洋葱槲皮素[33]可促进胸腺、脾脏法氏囊的发育，且洋葱槲皮素可提高巨噬细胞的吞噬功能，诱导巨噬细胞IL-4和白细胞介素-12（IL-12）分泌，进而提高机体的免疫功能。4结论本试验结果表明，ev3在地方品种太行鸡中的整合率高于培育品种大午金凤，ev3整合提高了太行雏鸡血清IgG和IL-4的含量，降低了出雏重以及大午金凤鸡血清IgM含量。ev6在太行鸡和大午金凤鸡中的整合率无显著差异，但太行鸡血清IL-10含量显著降低；ev21整合降低了太行雏鸡的体重和免疫性能，提高了大午金凤鸡的血清IL-4含量。ev3、ev6和ev21整合对太行雏鸡和大午金凤雏鸡的脾脏指数、胸腺指数和血清IgA含量均无显著影响。此外，慢羽鸡血清IgG含量高于快羽鸡，太行母雏鸡的体重、免疫器官总重和血清IgG含量高于公鸡。