在导管类医疗器械的开发设计中，考虑产品的加工性和实用性，经常用到光固化油墨和涂层[1]。由于医疗器械多与人体血液或体液接触，这些聚合物的选取和使用不仅需要满足产品功能要求，更要满足安全性。在光固化体系中，光引发剂利用其感光基团在光吸收过程中产生活性成分，引发单功能或多功能单体聚合交联[2]。2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)作为自由基型光引发剂，具有固化速度快、价格便宜等优点而广泛应用[3-4]。但DMPA在使用时一般添加量较大，光照后剩余引发剂可能释放有害的气体[5]，危害人体健康。自2005年光引发剂在食品中被检出后，人们开始关注DMPA检测[6]，测定对象由食品包装扩展到医疗器械产品中的残留及迁移[7]。甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(HEMA)是树脂类材料在固化后释放的1种主要单体成分。有研究显示，HEMA可以影响免疫系统的很多功能[8]。一定浓度的HEMA可使细胞变性，抑制细胞增殖和I型胶原的合成[9]。在许多体外实验研究中发现HEMA具有细胞毒性作用[10-11]。HEMA和DMPA的分子量较小，在一定的条件下发生化学迁移，从而对人体的健康造成潜在危害[12]。本实验建立HPLC测定HEMA和DMPA溶出量的方法，为控制医疗器械产品的质量提供了快速、准确的测定方法。1实验部分1.1主要原料甲醇，色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙醇，色谱纯，烟台市双双化工有限公司；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(HEMA)，纯度99.5%，成都艾科达化学试剂有限公司；纯水/超纯水系统，Milli-Q，德国默克公司；穿刺器，CCQ20230108（一组）、CCQ20230109（二组），河南驼人医疗器械研究院有限公司1.2仪器与设备高效液相色谱仪(HPLC)，Waters 2695-2489、紫外-可见分光光度计，UV-5800PC，上海元析仪器有限公司。1.3样品预处理标准品溶液：分别精密称取HEMA、DMPA标准品1.000 0 g，用甲醇稀释至100 mL，得到HEMA和DMPA质量浓度为10 mg/mL的标准品溶液。浸提溶剂：用乙醇和超纯水，通过精密天平配制密度为0.937 5 g/mL的乙醇水混合液作为浸提溶剂[13]。取两组不同批次的穿刺器，将样品粉碎至粒度小于2 mm后混匀，以每0.2 g质量加1 mL的比例添加浸提溶剂，放入250 mL密封锥形瓶中，在(37±1) ℃条件下恒温8 h，将样品与液体分离，冷至室温，取浸提液经0.22 μm的滤膜过滤，每组平行浸提3次[14-15]。1.4实验方法1.4.1色谱条件检测器：紫外/可见波长检测器，检测波长220 nm。色谱柱：waters XBridge C18柱，5.0 μm，4.6 mm×150 mm，柱温25 ℃。流动相：甲醇-水梯度洗脱。表1为梯度洗脱程序。流量1.0 mL/min，进样量10 μL。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T001表1梯度洗脱程序Tab.1Gradient eluted program洗脱程序时间/min甲醇/%水/%10406025802032580201.4.2标准曲线的制作将10 g/L HEMA和DMPA标准品溶液用浸提溶剂稀释，使其质量浓度分别为200.0、100.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 μg/mL，所有溶液使用0.22 μm滤膜过滤，检测时每个浓度平行测试3次，计算色谱峰的平均值，将色谱峰的峰面积与浓度对应绘制标准工作曲线。2结果与讨论2.1浸提方式的选择对于导管类医疗器械，常用浸提液的制备方式有管体循环对接蠕动泵回流、整体浸泡、粉碎浸泡等方式[16-18]。本实验采用密度为0.937 5 g/mL的乙醇水混合液作为浸提溶剂，考虑产品的安全性需要测试最大溶出量。相比整体浸泡，样品粉碎浸泡的接触面更大，溶出量更多，优先选用此方法。与管体对接循环回流方式对比，选取不同生产日期和老化后的产品进行测试，发现使用管体对接回流方法检测，随着老化时间的增加，溶出物检测值增大，需要将样品长时间浸提后检测结果才趋于稳定，是溶出物缓慢自迁移导致[19]。而粉碎浸泡的检测数值短时间可以达到稳定，优选该浸提方式。2.2色谱柱的选择为更好地对溶出物HEMA和DMPA进行定量分析，比较XBridge C18柱(5.0 μm，4.6 mm×150 mm)、symmetry C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm)、symmetry C8柱(5.0 μm，4.6 mm×150 mm)对色谱峰的影响。采用symmetry C18柱(5.0 μm，4.6 mm×250 mm)、symmetry C8柱(5.0 μm，4.6 mm×150 mm)时，部分色谱峰出现峰形对称性差、拖尾、响应值低等现象，不利于溶出物的定量检测，最终确定选用XBridge C18柱(5.0 μm，4.6 mm×150 mm)[20]。2.3色谱条件选择2.3.1检测波长的选择图1为HEMA和DMPA的紫外吸收光谱。图1HEMA和DMPA的紫外吸收光谱Fig.1UV absorption spectra of HEMA and DMPA10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.F1a1（a）HEMA10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.F1a2（b）DMPA从图1可以看出，HEMA的最大吸收波长在209 nm，在230 nm以上无吸收；DMPA的最大吸收波长在255 nm。为了兼顾二者的吸收响应信号，并尽可能减少HPLC流动相的末端吸收对测定的干扰[21-22]，确定220 nm为HPLC的检测波长。在220 nm波长下，HEMA和DMPA具有较好的信号响应。2.3.2流动相的选择为减少溶剂的末端吸收，选择甲醇-水作为流动相。由于HEMA和DMPA的极性差别较大，在等度洗脱条件下，无法在较快速的情况下完成两种物质的同时分析测定，因此采用梯度洗脱[23]。图2为HEMA和DMPA标准品的HPLC谱图。从图2可以看出，在此色谱条件下，HEMA和DMPA的保留时间分别为2.5 min和6.9 min。样品中其他浸提物质及溶剂杂质等对HEMA和DMPA的检测无干扰，能够实现在10 min内同时检测HEMA和DMPA物质[24]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.F002图2HEMA和DMPA标准样品的HPLC谱图Fig.2HPLC spectra of standard HEMA and DMPA2.4线性关系分析按照1.4.1中HPLC条件，对质量浓度分别为200.0、100.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 μg/mL HEMA和DMPA混合溶液进行分析测定，每个浓度重复测3次，得到各浓度峰面积平均值。以峰面积Y为纵坐标，HEMA和DMPA质量浓度X(μg/mL)为横坐标，得到0.5~200.0 μg/mL范围内HEMA和DMPA的标准工作曲线。考虑到导管类医疗器械中HEMA和DMPA溶出量较小，利用整个线性范围工作曲线确定HEMA和DMPA溶出量时会存在一定的误差。为了尽可能准确地测定导管类医疗器械中HEMA和DMPA，采用较低浓度范围的工作曲线。通过计算发现，HEMA和DMPA在0.5~20.0 μg/mL范围内，呈现良好的线性关系，线性回归系数r均大于0.999。表2为HEMA和DMPA在不同线性范围内工作曲线的线性参数。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T002表2HEMA和DMPA在不同线性范围内工作曲线的线性参数Tab.2Linearity parameters of working curves of HEMA and DMPA in different linear ranges检测物线性范围/（μg‧mL-1）工作曲线回归系数rHEMA0.5~20.0Y=1.989×104X+3.891×100.9999HEMA0.5~200.0Y=1.949×104X+1.295×1040.9991DMPA0.5~20.0Y=1.551×104X-4.576×1020.9997DMPA0.5~200.0Y=1.412×104X+2.539×1030.99912.5灵敏度分析取HEMA和DMPA标准品溶液用浸提溶剂逐级稀释，得到一系列质量浓度的标准工作溶液进样测定，表3为HEMA和DMPA的检出限结果。从表3可以看出，当HEMA的质量浓度为0.01 μg/mL时，信噪比S/N=3.1，由此确定在1.4.1色谱条件下HEMA的检测限为0.01 μg/mL。当DMPA的质量浓度为0.04 μg/mL时，信噪比S/N=3.2，由此确定在1.4.1色谱条件下DMPA的检测限为0.04 μg/mL。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T003表3HEMA和DMPA检出限结果Tab.3Results of detection limit of HEMA and DMPA检测物浓度/（μg‧mL-1）峰面积信噪比S/NHEMA0.012.4993.1DMPA0.046.9413.22.6精密度分析取HEMA和DMPA质量浓度分别为10.0、20.0、100.0、200.0 μg/mL标准工作溶液，按照1.4.1色谱条件进样测定，每种浓度样品连续进样测定5次，得到其峰面积，计算变异系数(RSD)。表4为HEMA和DMPA精密度结果。从表4可以看出，RSD均为小于1%，表明此方法在较宽的线性范围内具有较好的精密度[25]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T004表4HEMA和DMPA精密度结果Tab.4Results of precision of HEMA and DMPA标样质量浓度/（μg‧mL-1）峰面积峰面积峰面积峰面积峰面积平均值RSD/%HEMA10.0196636196157198283198247198444197553.40.4920.0398243400089395899389553399571396671.00.97100.0206380720766002054101207379120727112068202.00.40200.0387519538862443906021389374738952203891285.40.26DMPA10.0152046151903151365152218152152151936.80.2020.0311137311137312701314029311814312163.60.35100.0134692513526601348823134969113514721349914.20.15200.0289573228922912896203289807928964942895759.80.072.7样品稳定性实验分别准确称取HEMA和DMPA标准品5 mg，置于10 mL容量瓶，用甲醇溶解定容。分别取0.50 mL HEMA和DMPA溶液置于10 mL容量瓶，用浸提溶剂稀释定容，为100 μg/mL的样品溶液，分别在0、2、4、6、8 h用1.4.1色谱方法测定HEMA和DMPA峰面积。表5为稳定性实验结果。从表5可以看出，峰面积相对标准差(RSD)分别为0.19%和0.12%，表明在此测定环境中样品稳定性较好[26]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T005表5稳定性实验结果Tab.5Results of stability test标样放置时间/h保留时间/minRSD（保留时间）/%峰面积RSD（峰面积）/%HEMA02.4990.2520218230.1922.492201581342.484202638962.497201688982.5022022212DMPA06.9540.2015935660.1226.933159490746.916159584466.935159898386.95015939172.8加样回收率准确称取3份浸提液各2.000 mL，分别与质量浓度为100.0、50.0、10.0 μg/mL的混合标准溶液定容至10 mL，得到高、中、低三种质量浓度的加标回收样品溶液，按1.4.1色谱条件对每个加标回收样品溶液测定3次，高、中质量浓度利用0.5~200.0 μg/mL得到的标准工作曲线计算回收率，低质量浓度利用0.5~20.0 μg/mL得到的标准工作曲线计算回收率[27-28]。表6为加标回收率试验结果。从表6可以看出，回收率均在90%~110%之间，RSD小于0.5%，说明本方法准确度高，精确度好[29-30]。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T006表6加标回收率试验结果Tab.6Results of tests for recovery标样加标浓度/（μg‧mL-1）检出浓度/（μg‧mL-1）回收率/%RSD/%HEMA10.09.4094.00.0950.046.6393.30.04100.094.6094.60.48DMPA10.09.8098.00.0650.051.40100.30.13100.097.0097.00.492.9浸提液中HEMA和DMPA溶出物的测定将穿刺器浸提液按1.4.1条件对每组穿刺器浸提3次并测定，得到峰面积平均值，将峰面积代入线性回归方程得到HEMA和DMPA的质量浓度，表7为样品测定结果。10.15925/j.cnki.issn1005-3360.2023.08.017.T007表7样品测定结果Tab.7Sample determine result编号浸提次数HEMA峰面积HEMA质量浓度/（μg‧mL-1）DMPA峰面积DMPA质量浓度/（μg‧mL-1）一组No.1n.d0.01n.d0.04一组No.2n.d0.01n.d0.04一组No.3n.d0.01n.d0.04二组No.18280.0439910.29二组No.26770.0335820.26二组No.37270.0337090.27注：n.d表示检测不到信号，即溶出浓度小于方法最低检测限。从表7可以看出，第一组样品未检测出HEMA和DMPA，第二组样品中含有少量的HEMA和DMPA，检出量平均值分别为0.03 μg/mL和0.27 μg/mL。结果表明，本方法适用于HEMA和DMPA含量的测定[31]。3结论本实验建立的HPLC法对于HEMA和DMPA在0.5~200.0 μg/mL的较宽浓度范围保持良好的线性关系。样品前处理选择粉碎浸提，能短时间达到最大溶出量。选用XBridge C18柱进行分离，检测波长选择220 nm，流动相使用甲醇和水进行梯度洗脱，能同时快速检测HEMA和DMPA两种物质，且峰形良好。不同规格、不同厂家的导管类医疗器械产品，在临床使用过程中HEMA和DMPA溶出量可能相差较大，HPLC标准曲线的较宽线性范围则能很好地适应产品特点，有利于确保检测的可靠性。同时精密度和回收率试验也表明此方法准确度高、精确度好且操作简单、分析快速，易于实操。