烟酰胺单核苷酸（NMN）是一种由烟酰胺基团和5-磷酸核糖缩合形成的核苷酸，其中烟酰胺的氮与核糖的（β）c-l相连[1]。烟酰胺单核苷酸具有α和β两种构型，其中β型具有更好的生物活性[2]，其参与许多生物过程，如NMN可以参与糖、脂肪和蛋白质代谢，是多种细胞酶的重要辅助因子。NMN是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的关键前体之一[3]。NMN具有维持氧化还原平衡状态、调节细胞的各种代谢活动等生理功能，这些功能主要是通过NMN在体内转化成NAD+实现[4]。烟酰胺单核苷酸可以改善动物胚胎发育，促进畜禽生长，预防动物消化系统疾病。目前，烟酰胺单核苷酸的研究热点集中在药品和食品方面，在动物生产方面的研究鲜有报道。本文系统地讨论了烟酰胺单核苷酸近年来在合成、检测和动物生产中的应用所取得的进展，以期为烟酰胺单核苷酸在动物生产中的应用提供参考。1烟酰胺单核苷酸的合成1.1化学合成烟酰胺单核苷酸的化学合成研究较早[5]，并率先实现规模化生产[6]。化学合成法主要以烟酰胺（NAM）、三苯甲酰基‑β‑D‑核糖、四乙酰核糖等作为原料通过糖基化、磷酸化、氨解等不同的合成步骤完成[7]。陈怡璇等[8]在整理5条NMN的合成路线基础上发现，烟酸乙酯和四乙酰核糖为原料合成烟酸乙酯三乙酰核苷，经脱保护基磷酸化氨解酸化，NMN收率超过65%，纯度达到95%以上。索韦等[9]研究发现，以烟酰胺核糖与缩酮化试剂为原料，在酸催化剂存在下反应得到β-烟酰胺单核苷酸，其收率在80%~90%。Lee等[10]采用溴代乙酰核糖法，经溴代、氨解、磷酸化等步骤，纯化制得β-烟酰胺单核苷酸，发现β-烟酰胺单核苷酸总收率达到57%。Tanimori等[11]用NAM和四乙酰核糖为原料，经过三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）的催化、缩合得到三乙酰基烟酰胺核苷三氟甲磺酸盐，后经脱乙酰基、色谱分离、重结晶等步骤得到烟酰胺核苷盐，再经磷酸化后可得NMN，发现NMN产率为58%。魏霞蔚等[12]以四乙酰核糖和烟酸乙酯为起始原料，经缩合、脱乙酰基、磷酸化、氨解等步骤，发现NMN总收率约为64%，纯度大于97%。潘钦孩[13]以烟酰胺为原料经优化的糖苷化、氨解及磷酸化合成NMN，其中糖苷化以1, 2-二氯乙烷为反应溶质，1.2eq SnCl4为催化剂，50 ℃反应1.5 h，结果发现，NMN收率为91.8%，氨解以3 eq正丙胺甲醇溶液为溶剂，-5 ℃反应8 h，发现NMN收率为52%，磷酸化以磷酸三甲醋为溶剂，1.2eq POCl3为磷酸化试剂，0 ℃反应12 h，NMN收率为83.2%。化学合成制备NMN存在原料易得、步骤短、收率较高、工业放大容易等优点，但是化学合成过程中普遍应用有机溶剂，考虑到食品安全问题，化学合成的NMN在动物生产中的应用具有局限性。因此，生物合成法产生NMN已经成为当下研究热点[14]。1.2生物合成生物合成法是利用微生物或其他生物细胞通过代谢途径合成NMN，与化学合成法相比，生物合成法具有副产物少、反应条件温和、立体结构选择性高、产品纯度高等优势，且不存在有机溶剂残留与手性分离问题。NMN生物合成制备方法包括微生物发酵法和酶催化法。1.2.1微生物发酵法微生物发酵法由于底物产物非常容易被菌体消耗利用，不易大量积累，生产效率低下，不利于工业化生产。Marinesu等[15]利用含有NMN代谢酶相关的大肠杆菌发酵制备NMN，发现NMN的产量为15.42 mg/L。Black等[16]设计大肠杆菌全细胞的生物合成途径制备NMN，结果发现，试验虽然不需要额外添加辅助因子，但是NMN产量仅有0.5 g/L左右（1.5 mmol/L），无法进行工业化生产。施玲慧等[17]以AMP、ATP、NAM为底物，在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中构建AMP核苷酶（AMN）与磷酸核糖焦磷酸合成酶（PRS）的共表达及融合表达体系，一锅法生物合成NMN，发现反应2 h时，NMN产量达到23.7 mmol/L，总收率达33.4%。程琳等[18]同样使用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达宿主，通过引入外源松噬几丁质菌的NAMPT基因，有利于NMN积累，通过敲除NMN下游代谢分解途径基因pncC、ushA以及调控NAD+衍生物基因nadR，使菌株的摇瓶最高产量为60 mg/L，5 L发酵罐产量达到390.1 mg/L。Shoji等[19]报道了1种NMN高产量的发酵法，通过构建可以摄入葡萄糖和烟酰胺的重组大肠杆菌、不同来源的烟酸转运蛋白（NiaP）、烟酰胺核苷转运蛋白（PunC）和NAMPT酶，最终使NMN产量达到6.79 g/L。1.2.2酶催化法生物催化法一般是以烟酰胺和磷酸核糖基焦磷酸为底物，模仿生物体内NMN的反应路径，在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成NMN。廖一波[20]在筛选高效合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶的基础上，比较了单酶法、双酶法和三酶法合成NMN的差异，发现单酶法通过补加一次底物5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP），NMN产量最高可达34 mg/L，合成效率为204 mg/(L·h)。陶军华等[21]以烟酰胺核糖和ATP为初始物，经过烟酰胺核糖激酶的催化作用，烟酰胺核糖转化率达90%以上，经后处理纯化得到的NMN纯度大于95%。竺伟等[22]以烟酰胺（NAMPT），ATP和D‑5‑磷酸核糖为原料，其中NAMPT为催化组分，NMN的最高产量可达13.3 g/L，当底物浓度10~30 g/L，预计收率可以大于70%。祝俊等[23]研究表明，pH值6~7，10~50 g/L的烟酰胺核糖激酶突变体能高效催化制备烟酰胺单核苷酸（NMN），转化率高于90%。生物酶催化法虽然需要复杂的发酵过程，操作难度也较大，但是具有成本低、产量高、不含有机溶剂残留等优点，且制备的NMN与机体内的同型，是一种较为绿色环保的制备方法。2烟酰胺单核苷酸的检测方法NMN具有分子极性大、不易挥发、易溶于水、难溶于有机溶剂的性质[24]。NMN常用的定性定量分析方法包括毛细管电泳法（CE）[25]、液相色谱-紫外法（HPLC-UV）[26]、核磁共振波谱法（NMR）[27]、液相色谱-质谱法（HPLC-MS）[28]等。高效液相色谱法[29-30]测定β-烟酰胺单核苷酸（NMN）胶囊和NMN片剂基质中NMN含量，检出限（LOD，信噪比S/N=3）为1.0 mg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）为3.0 mg/kg，稳定性为0.6%，重复性相对标准偏差（RSD）为0.6%，此方法具有较好的重现性、精密度、稳定性、重复性。核磁共振氢谱法[31]测定含NMN含量，使用对苯二酚作为内标，以NMN中δ8.89峰为定量峰，对苯二酚中δ6.67的峰为内标定量峰，根据积分峰面积比与质量比计算NMN的含量，定量分析复杂基质样品中，核磁共振氢谱法测得的NMN平均含量为0.67%，RSD为1.88%，与标示量0.7%接近。液相色谱-串联质谱[32]能快速测定β-烟酰胺单核苷酸，方法的定量限0.142 5 μg/L（S/N=10），检出限为0.07 μg/L（S/N=5），质量浓度为0.142 5~228 μg/L时回收率为86.6%~108.0%，RSD为3.4%；方法的重现性好，RSD为2.22%，能够快速测定蔬菜、水果、药物中β-烟酰胺单核苷酸。3烟酰胺单核苷酸在动物生产中的应用NMN的应用目前主要集中在医学和食品领域[33]，在动物生产中的应用报道较少，但是NMN可以改善动物胚胎发育，促进畜禽生长，预防动物消化系统疾病等。3.1改善代谢功能长期规律性地补充NMN可以有效提高胰腺[34]、脂肪组织[35]、骨骼肌[36]、心脏[37]、脑组织[38]等各种外周组织NAD＋的生物合成，从而避免NAD＋水平下降导致动物机体中需要NAD＋参与的生理生化过程的失能，如代谢综合征、骨骼肌线粒体功能障碍等。Mills等[39]给正常野生型C57BL/6N小鼠长期（1年）口服NMN（300 mg/kg mb）发现，NMN能够有效抑制年龄引起的小鼠体质量增加，改善胰岛素敏感性和血脂，增加能量消耗和改善肌肉线粒体的功能，并且小鼠对NMN耐受性良好，未发现明显的有害或毒性作用。对于脂肪细胞特异性NAMPT敲除小鼠（ANKO）中，饲喂高剂量NMN（500 mg/kg mb·d）4~6周，小鼠脂肪组织NAD＋生物合成明显增强，NAD-依赖性去乙酰化酶（SIRT1）活性明显提高，逆转了胰岛素敏感性，降低了血糖和血浆甘油三酯水平[35]。Ryoei等[40]用NMN处理哺乳动物肠上皮类器官后发现，类器官的NAD+水平更高，且NMN可以增强哺乳动物细胞增殖能力，抑制衰老相关基因，表明NMN处理可以改善肠上皮衰老相关的变化。骨骼肌是NMN抗衰老最敏感的靶组织之一[41]。沈龙仙等[42]利用1 μg/mL NMN处理浙东白鹅骨骼肌卫星细胞，结果显示，NMN可以显著上调骨骼肌卫星细胞Pax7基因的mRNA表达和蛋白表达，显著下调MSTN基因的mRNA表达和蛋白表达，与1 mg/L褪黑素（MLT）共同处理的效果更为显著。3.2提高生殖功能李乐义[43]以猪体外培养的卵母细胞和孤雌激活早期胚胎为主要研究对象，检测NMN对老化猪卵母细胞的影响，结果表明，NMN能够延缓猪卵母细胞的老化，改善老化猪卵母细胞的早期胚胎发育能力，可通过修复老化胚胎中异常的DNA甲基化和组蛋白甲基化修饰水平，进而改善老化卵母细胞的早期胚胎发育能力。Miao等[44]以排卵后老化的猪卵母细胞为试验对象，通过补充浓度为100 μmol/L NMN，发现NMN可明显提高排卵后老化的猪卵母细胞质量，这可能是由于NMN能增强线粒体功能、抑制氧化应激诱导的细胞凋亡造成。徐茜等[45]用牛卵母细胞置于含1 μmol/L NMN的培养液中进行体外成熟、玻璃化和体外受精，发现NMN玻璃化组牛卵母细胞的ROS水平和凋亡水平也显著低于玻璃化对照组，并且解冻后的卵裂率、存活率和囊胚率均显著高于玻璃化对照组，表明NMN可以有效降低牛卵母细胞的脂滴含量，降低玻璃化牛卵母细胞的ROS水平和凋亡水平，从而提高玻璃化牛卵母细胞的发育能力。Xu等[46]研究发现，1 mol/L NMN、2.5 mol/L 黄连素（BER）和1 mol/L虫草素（COR）能够降低牛卵母细胞中脂滴含量，抑制参与脂质合成的基因的表达水平，降低玻璃化牛卵母细胞中ROS和细胞凋亡的水平，降低了参与内质网应激和线粒体分裂的基因的mRNA表达水平，但提高了与线粒体融合相关的基因的信使核糖核酸表达水平，但用1 mol/L NMN处理的玻璃化牛卵母细胞具有显著更高的存活率和更好的发育能力，1 mol/L NMN比2.5 mol/L BER和1 mol/L COR效果更好。研究表明，给小鼠母体体内补充NMN，老化的卵母细胞NAD+水平得到显著提高，卵母细胞的成熟率、受精能力和随后的胚胎发育潜力得到明显改善，这可能是因为补充NMN恢复了体内线粒体功能，减少活性氧的聚集，抑制衰老过程的发生，从而改善衰老卵母细胞的质量[47]。4展望为了推广NMN在动物生产中的应用，未来需要进一步研究NMN的合成技术和工艺，以提高NMN产量，降低成本；深入研究烟酰胺单核苷酸的生物学作用机制，更好地发挥NMN在动物生产领域的应用价值；对NMN进行安全性评价和风险控制，以确保NMN在应用过程中不会对动物健康和环境造成危害。