抗生素具有防病治病、促进生长等功效，但是抗生素的不规范使用引发了畜禽产品药物残留、细菌耐药性增强等诸多安全问题，寻找替代抗生素的饲料添加剂迫在眉睫[1]。微生态制剂是一种由有益微生物及其代谢产物通过特殊工艺生产制得的生物活性细菌制剂[2-3]，是一种安全、不易产生耐药性的替抗添加剂，具有促进动物生长、提高饲料转化率、提高机体免疫能力以及改善饲养环境和畜禽产品品质等优点[3]，可用于畜禽健康养殖。复合微生态制剂是将多种有益菌（乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌、芽孢杆菌、醋酸杆菌等）复合，从而协同发挥多种菌的生物学活性[4-5]。本试验以海兰褐蛋鸡为研究对象，比较不同添加剂量的复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡生产性能、蛋品质、血清免疫指标和肠道菌群的影响，以期为复合微生态制剂在蛋鸡生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料复合微生态制剂购自甘肃易牧兴农生物制药有限公司，含有嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、抗菌肽等有效成分，活菌总数≥1×109 CFU/g。试验蛋鸡购自甘肃众鑫果果农业科技有限公司。1.2试验饲粮与饲养管理基础饲粮参照NRC（1994）、《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）和《海兰褐商品代蛋鸡饲养管理手册》配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T001表1基础饲粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米65.88粗纤维/%5.00豆粕24.00粗蛋白质/%18.00蛋氨酸0.16钙/%3.60赖氨酸0.14总磷/%0.55食盐0.32蛋氨酸/%0.32石粉8.50赖氨酸/%0.79预混料1.00粗灰分/%7.00代谢能/(MJ/kg)12.14注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 8 000 IU、VB1 1.5 mg、VB2 3.6 mg、VB6 2.5 mg、VB12 12 μg、VD3 3 000 IU、VE 20 mg、Fe 50 mg、Zn 60 mg、Cu 9 mg、Mn 61 mg、I 0.6 mg、Se 0.2 mg、D-泛酸11 mg、胆碱480 mg、叶酸0.65 mg、烟酸35 mg、生物素0.1 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。试验在甘肃省武威市凉州区某蛋鸡场进行，试验鸡饲养在同一栋鸡舍内，采用四层立体笼养，自由采食、饮水，执行正常的免疫程序。每天15：00捡蛋，光照时间16 h/d，光照强度20 Lx，机械通风，每周消毒1次。1.3试验设计选取健康的体重、产蛋率相近的海兰褐蛋鸡（42周龄）400羽，随机分为4组，每个处理组5个重复，每个重复组20羽鸡。对照组蛋鸡饲喂基础饲粮，试验Ⅰ组在基础饲粮中添加0.5%的复合微生态制剂，试验Ⅱ组在基础饲粮中添加1.0%的复合微生态制剂，试验Ⅲ组在基础饲粮中添加1.5%的复合微生态制剂。预试期3 d，试验期42 d。1.4测定指标及方法1.4.1生产性能试验开始后，每天记录各重复蛋鸡的死淘数、总蛋重、产蛋数以及不合格蛋数（软壳蛋、破蛋、畸形蛋、沙皮蛋等），每周统计各重复的饲料消耗量，根据统计的数据计算每天每个重复的采食量、死淘率、料蛋比、平均蛋重、产蛋率和不合格蛋率。平均日采食量=采食总量/(存栏只数×试验天数)(1)死淘率=死淘数/饲养鸡数(2)料蛋比=耗料量/总蛋重(3)平均蛋重=总蛋重/产蛋数(4)产蛋率=产蛋数/存栏只数×100%(5)不合格蛋率=不合格蛋数/产蛋数×100%(6)1.4.2蛋品质试验结束前3 d，连续每天随机从每组选出25枚（每个重复5枚）蛋重接近的鸡蛋用于蛋品质测定。蛋重、蛋黄颜色、哈夫单位采用EA-01型蛋品质测定仪测定，蛋黄重采用电子天平测定，蛋形指数采用电子数显游标卡尺测鸡蛋纵径和横径，以短径/长径表示，蛋壳强度采用FESTV2.0型蛋壳强度仪测定，蛋壳厚度采用NFN-380型蛋壳厚度计测定，蛋黄比重为蛋黄重量与鸡蛋重量的比值。1.4.3血清免疫指标试验结束时，每个重复随机选择1羽蛋鸡，翅下静脉采血10 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液，放置-20 ℃冰箱，检测血清中的免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）含量。以上5个指标均采用ELISA试剂盒测定，试剂盒购自上海科艾博生物，具体操作方法参考试剂盒操作说明进行。1.4.4肠道菌群将蛋鸡屠宰后，选取盲肠肠段，保存至液氮中。采用平板菌落计数法进行统计。从液氮中取出样品，在无菌操作台中称量盲肠食糜0.5 g，将其放入装有4.5 mL无菌生理盐水的灭菌离心管中，采用振动器混匀，制成10-1倍稀释液；再将10-1倍稀释液离心，在无菌操作台中采用灭菌吸管吸取0.5 mL上清液，滴入装有4.5 mL无菌生理盐水的灭菌试管中，振荡混匀，制成10-2倍稀释液，重复上述操作，直至稀释至10-7，每个稀释度3个重复。微生物检测所用培养基和培养条件见表2。培养基购自凯恒生物科技发展有限公司。菌群数量以每g盲肠内容物中细菌个数的对数lgCFU/g表示。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T002表2微生物检测用培养基和培养条件细菌种类培养基培养条件乳酸杆菌LBS37 ℃、8 h，厌氧双歧杆菌BS37 ℃、48 h，厌氧沙门杆菌HE37 ℃、24 h，有氧大肠杆菌EMB37 ℃、24 h，有氧1.5数据统计与分析采用SPSS 21.0软件对试验数据进行单因素方差统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡生产性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡平均日采食量分别显著下降2.15%、2.33%、2.44%（P0.05）。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡的料蛋比均显著分别比对照组下降了2.83%、6.60%、7.08%（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡的料蛋比比试验Ⅰ组下降3.88%、4.37%（P0.05），试验Ⅱ组、Ⅲ组间差异不显著（P0.05）。研究表明，不同剂量的复合微生态制剂可以显著降低蛋鸡的平均日采食量和料蛋比，且以1.5%的添加量效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T003表3复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡生产性能的影响组别平均日采食量/(g/只)死淘率/%料蛋比/%平均蛋重/(g/枚)产蛋率/%不合格蛋率/%对照组115.75±1.29a1.422.12±0.09a62.12±1.5291.72±1.654.95±0.52试验Ⅰ组113.25±1.15b0.982.06±0.04b62.52±1.2791.72±1.754.05±0.27试验Ⅱ组113.05±1.18b0.651.98±0.06c62.90±1.4192.02±1.933.95±0.33试验Ⅲ组112.92±1.26b0.661.97±0.06c63.01±1.1292.06±1.773.90±0.49注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）下表同。2.2复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡蛋品质的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组鸡蛋的蛋壳强度、蛋黄比重均显著提高（P0.05），其蛋壳强度分别提高了2.16%、2.64%、2.64%，蛋黄比重分别提高了1.90%、2.51%、3.11%，但3个试验组间蛋壳强度、蛋黄比重无显著差异（P＞0.05）。试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组鸡蛋的蛋壳厚度、哈夫单位、蛋黄颜色指标均高于对照组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T004表4复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡蛋品质的影响组别蛋形指数蛋壳强度/(kg/cm2)蛋壳厚度/mm哈夫单位蛋黄比重蛋黄颜色对照组1.29±0.044.16±0.85b0.36±0.0287.00±8.2123.12±1.25b6.19±0.56试验Ⅰ组1.30±0.014.25±0.80a0.37±0.0388.00±8.1523.56±2.13a6.30±0.48试验Ⅱ组1.30±0.024.27±0.80a0.43±0.0688.00±7.9523.70±1.21a6.42±0.51试验Ⅲ组1.29±0.014.27±0.78a0.47±0.0488.00±9.2123.84±2.21a6.29±0.32研究表明，在蛋鸡的基础饲粮中添加一定剂量的复合微生态制剂可提高蛋品质，且以1.5%的添加量为宜。2.3复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡血清免疫指标的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡血清中的IgG含量分别提高了3.22%、8.87%、12.5%（P0.05），而试验Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡血清IgG含量比试验Ⅰ组显著提高了5.47%、8.98%（P0.05）。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡血清中的TNF-α含量分别降低了43.6%、51.98%、54.85%（P0.05）。研究表明，在基础饲粮中添加一定剂量的复合微生态制剂可提高蛋鸡的免疫功能，添加量以1.5%为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T005表5复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡血清免疫指标的影响组别IgA/(g/L)IgG/(g/L)IgM/(g/L)TNF-α/(ng/L)IL-6/(ng/L)对照组1.34±0.072.48±0.12c1.65±0.0871.29±15.43a198.65±39.14试验Ⅰ组1.39±0.122.56±0.09b1.66±0.1440.21±11.45b206.43±54.32试验Ⅱ组1.44±0.092.70±0.14a1.66±0.1734.23±10.31b219.19±36.57试验Ⅲ组1.47±0.112.79±0.23a1.69±0.0532.19±12.13b235.43±57.562.4复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡肠道菌群的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡盲肠中的乳酸杆菌数量分别增加了4.63%、12.55%、14.49%（P0.05）；与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡盲肠中乳酸杆菌数量显著增加（P0.05）；与试验Ⅱ组相比，试验Ⅲ组蛋鸡盲肠中乳酸杆菌数量显著增加（P0.05）。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡盲肠中的双歧杆菌数量均有所增加，但差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比，试验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡盲肠中的大肠杆菌数量和沙门氏菌数量显著减少（P0.05），其中大肠杆菌数分别减少6.86%、10.53%、11.95%，沙门氏菌数分别减少3.25%、6.36%、8.14%。与试验Ⅰ组相比，试验Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡盲肠中的大肠杆菌数量显著减少（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.006.T006表6复合微生态制剂对海兰褐蛋鸡肠道菌群的影响组别乳酸杆菌双歧杆菌大肠杆菌沙门氏菌对照组8.21±0.43d7.21±0.258.45±0.54a6.76±0.42a试验Ⅰ组8.59±0.34c7.34±0.347.87±0.62b6.54±0.53b试验Ⅱ组9.24±0.21b7.69±0.197.56±0.64c6.33±0.27b试验Ⅲ组9.40±0.12a7.80±0.217.44±0.71c6.21±0.53blgCFU/g研究表明，在基础饲粮中添加一定剂量的复合微生态制剂可改善蛋鸡的肠道菌群，且以1.5%的添加量为佳。3讨论3.1复合微生态制剂对蛋鸡生产性能的影响由于蛋鸡的品种及日龄、菌种的种类及活性不同，复合微生态制剂对蛋鸡的生产性能的影响也不完全一致。戴维等[6]报道，饲粮中添加不同比例的微生态制剂对蛋重无显著影响。崔闯飞等[7]发现，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌对蛋重无显著影响。李晓丽等[8]报道，在饲粮中添加不同种类的微生态制剂可以提高蛋鸡的产蛋率，显著降低料蛋比。Xu等[9]研究发现，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌对蛋鸡产蛋率影响不显著，但可以显著降低蛋鸡的平均采食量和料蛋比。曾佳佳等[10]报道，在饲粮中添加中草药、益生菌、胆汁酸可减少海兰褐蛋鸡的平均日采食量。本试验发现，在饲粮中添加0.5%~1.5%的复合微生态制剂可降低蛋鸡的平均日采食量和料蛋比。原因可能是微生态制剂中的益生菌能够产生挥发性脂肪酸和乳酸，创造有利于乳酸菌、芽孢杆菌等有益菌生长的酸性环境，抑制有害菌的生长繁殖，维持菌群平衡[6]，改善肠道环境，保持肠道健康；益生菌能够产生多种酶，在消化过程中与体内的内源酶发生协同作用，促进消化酶的分解，有利于动物消化饲料中的营养物质；益生菌可以降解饲料中的抗营养因子，帮助肠道更好地消化吸收营养物质，提高饲料转化率，从而降低蛋鸡的平均日采食量和料蛋比。3.2复合微生态制剂对蛋品质的影响蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、哈夫单位、蛋黄比重、蛋黄颜色是评价蛋品质的重要指标[11]。蛋形指数对种蛋孵化率、健雏率具有明显影响，蛋壳强度反映了蛋的抗破损程度，哈夫单位可以反映鸡蛋的新鲜度和蛋白质量，而蛋黄颜色深且蛋黄大的鸡蛋更受消费者的喜爱。金福源等[12]发现，以罗曼粉壳蛋鸡为研究对象，在饲粮中添加0.1%的复合益生菌能够提高鸡蛋的蛋壳强度。裴跃明等[13]研究表明，在饲粮中添加一定比例的枯草芽孢杆菌制剂可以显著提高了蛋黄比重。岳道友等[14]报道，在基础饲粮中添加微生态制剂能够显著提高蛋壳强度和蛋黄比重。本试验表明，复合微生态制剂可以显著增加海兰褐蛋鸡的蛋壳强度和蛋黄比重。原因可能是益生菌降低肠道pH值，肠道内的酸性环境促进了钙盐的溶解，有利于钙和磷的吸收，从而增强蛋壳强度，改善蛋品质。3.3复合微生态制剂对蛋鸡血清免疫指标的影响IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，具有抗病毒、抗菌及免疫调节的功能；IgM主要由脾脏和淋巴细胞分泌合成，也具有抗菌、抗病毒及抗感染的生理作用；IgA在血清中含量较少，主要参与黏膜免疫[15]；TNF-α和IL-6是血清中的TNF-α和白细胞介素-6，是一类小分子可溶性蛋白质，可反映机体内的炎症水平。苏晓月等[16]研究表明，复合微生态制剂可显著提高蛋鸡血清中的IgG含量，有助于提高蛋鸡的免疫功能。何骥远等[2]发现，在京粉蛋鸡饲粮中添加不同水平的复合微生态制剂，可显著提高IgG含量，显著降低TNF-α含量。龙小文[17]研究表明，干酪乳杆菌可显著提高蛋鸡血清中的IgG含量。李安东等[18]报道，在饲粮中添加枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌能显著提高血清中IgG含量。本试验结果表明，复合微生态制剂能够显著提高蛋鸡血清中的IgG含量，显著降低TNF-α含量，而血清中的IgA、IgM、IL-6含量也有不同程度的提高，与以上研究基本一致，表明复合微生态制剂可以促进肠道淋巴细胞的成熟，从而增强体液免疫，提高机体免疫性能。3.4复合微生态制剂对蛋鸡肠道微生物的影响复合微生态制剂中的有益菌在繁殖过程中会消耗肠道内的氧，创造有利于厌氧菌生长的环境，抑制大肠杆菌和沙门氏菌的增殖，使肠道内的优势菌群产生多种活性物质与代谢产物，从而调节肠道菌群结构平衡，起抗菌防病的作用[19]。丁海[20]报道，枯草芽孢杆菌可显著增加蛋鸡盲肠中的乳酸杆菌数量，显著减少大肠杆菌数量和沙门氏菌数量。陈西风等[21]报道，在肉仔鸡饲粮中添加复合微生态制剂可显著增加肠道中的双歧杆菌数和乳酸杆菌数，减少沙门氏菌数和大肠杆菌数，维持肉仔鸡肠道菌群平衡。周芬等[22]报道，在饲粮中添加一定量的抗菌肽，可以使蛋鸡肠道菌群维持平衡。本试验的研究结果与上述报道一致，表明复合微生态制剂能够调节蛋鸡肠道菌群的平衡。4结论在饲粮中添加复合微生态制剂能够改善蛋鸡生产性能和蛋品质，并通过提高机体的免疫性能、抑制肠道病原微生物的增殖维持蛋鸡机体健康。本试验条件下，基础饲粮中添加1.5%的复合微生态制剂较好。