固态发酵饲料可以改善饲料原料品质，促进畜禽消化代谢，改善畜产品品质[1]。但由于发酵饲料的微生物结构的复杂性和多样性，仍存在杂菌的污染、耐药菌株基因的转移、产有毒代谢产物的菌株等问题[2]。因此，为确保发酵饲料产业的可持续发展，必须科学严格筛选发酵菌株。本试验从发酵饲料中筛选出1株产纤维素酶的菌株进行分离鉴定，结合产酶定性分析、不同碳源对其产酶活性的影响，为发酵饲料产业化应用提供安全优质的微生物材料提供参考。1材料与方法1.1试验材料发酵饲料由天康饲料有限公司提供。1.2主要试剂和仪器羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、木糖、葡萄糖、微晶纤维素（MCC）、蛋白胨、葡萄糖、马铃薯琼脂培养基（PDA）、KH2PO4、MgSO4购自上海源叶生物科技有限公司。SW-CJ-2F型双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司），恒温恒湿培养箱（宁波江南仪器厂），立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司），AB204-N电子分析天平、THA-82A台式恒温振荡仪、DGX-9143B-2型数码电热鼓风干燥箱（上海福马实验设备有限公司），SMART生物显微镜（重庆奥特光学有限公司），HWS28恒温性水浴锅（上海一恒科技有限公司），UV5100紫外可见分光光度计（上海元析一起有限公司）。1.3培养基蛋白酶培养基：酪蛋白10.0 g、葡萄糖1 g、酵母膏10 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.1 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然。木聚糖酶培养基：木聚糖10.0 g、KNO3 1.0 g、MgSO4 0.5 g、NaCl 0.5 g、K2HPO4 0.5 g、琼脂20.0 g、蒸馏水1 000 mL，pH值6.0。脂肪酶培养基：(NH4)2SO4 0.5 g、NH4NO3 0.1 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、K2HPO4 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值8.0。待灭菌后，于60 ℃左右加含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄榄油乳化液12 mL。淀粉酶培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、淀粉1%、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL，pH值7.2。植酸筛养基：植酸钠0.1 g、葡萄糖3 g、NH4NO3 5 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、MnSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，pH值5.5。果胶酶培养基：果胶2 g、(NH4)2SO4 3 g、KH2PO4 1.4 g、Na2HPO4·12H2O 4.2 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然。葡萄糖氧化酶培养基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、NaNO3 4 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4 0.7 g/L、KCl 0.5 g/L、CaCO3 5 g/L、可溶性淀粉10 g、KI 1.7 g、脱氧胆酸钠0.2 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值5.6。产酶发酵培养基：碳源（分别为CMC-Na、木糖、葡萄糖、微晶纤维素和定性滤纸）8 g、蛋白胨4 g、KH2PO4 0.8 g、MgSO4 0.4 g、13 mL蒸馏水，灭菌CMC-Na组在121 ℃下灭菌20 min，pH值5.5。以上培养基均在121 ℃高压蒸汽条件下灭菌20 min。1.4测定指标及方法1.4.1菌株分离和形态鉴定取1 g曲霉培养物，制备10-1~10-5梯度稀释液，选择10-5稀释浓度进行玻璃珠涂布分离培养。平板倒置于30 ℃培养96 h。转接纯化后的菌液于甘油管（30%），于-80 ℃超低温保藏。根据菌落的形状、大小、颜色和表面特征，结合《发酵饲料生产导图》对获得的菌株进行初步的形态鉴定。1.4.2分子鉴定菌株选用通用引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）、ITS4（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）PCR扩增ITS序列。PCR扩增体系：Template 1 μL，引物各1 μL，2×Taq PCR Mix 12.5 μL，双蒸水（ddH2O）9.5 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸90 s，进行30次循环；72 ℃再延伸10 min，PCR产物8 ℃保温60 min。使用0.8%的琼脂糖凝胶验证PCR产物，将验证成功的产物送华大基因公司测序。利用Cluster W软件将测序拼接后的序列与NCBI中的相似序列进行多重比对，再通过MEGA7.0软件中基于Kimura-2的邻接（neighborjoining，NJ）法（bootstrap=1 000次）构建具有产纤维素酶活的菌株以及相关相似菌株的系统进化树。1.4.3产酶定性验证将纯化2代的菌液点样在蛋白酶、植酸酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、淀粉酶和葡萄糖氧化酶定性培养基上，30 ℃培养3 d。若能产生蛋白酶、植酸酶和果胶酶，培养基上会出现透明圈。使用0.2%的刚果红进行染色，1 mol/L的NaCl进行洗脱，若能产生内切葡聚糖酶、木聚糖酶，培养基上则会出现透明圈；若能产生脂肪酶，培养基则会出现黄色；若能产生淀粉酶，培养基上会发生颜色变化；若能产生葡萄糖氧化酶，培养基上则会出现颜色变化。1.4.4不同碳源诱导黑曲霉产纤维素酶和木聚糖酶酶活将纯化2代的黑曲霉菌液以5%的接种量接入发酵培养基试管中，30 ℃恒温恒湿培养箱中培养5 d，每天早上和下午分别摇晃发酵培养基试管3 min，测定不同碳源诱导黑曲霉产内切葡聚糖酶、滤纸酶和木聚糖酶的第1~5 d的酶活，以确定不同碳源诱导黑曲霉产纤维素酶活和木聚糖酶活的影响。1.4.5酶活测定方法内切葡聚糖酶酶活、滤纸酶活和木聚糖酶活活力分析方法按照DNS显色法测定[3-4]。酶活力定义：每分钟从浓度7.5 g/L的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 µmol还原糖所需要的酶量为1个纤维素酶活力单位，以U表示。1.5数据统计与分析采用Microsoft Excel 2019对试验数据进行初步处理和图表绘制，SPSS 13.0软件对数据进行显著性分析。2结果与分析2.1菌株形态学观察结果（见图1）采用涂布平板，从发酵饲料中分离得到优势菌株。由图1可知，菌株培养24 h后，出现白色点状菌落；培养48 h后，白色点状菌落进一步扩大，表面光滑；培养72 h后，边缘开始产生白色菌丝，地毯式蔓延生长，呈同心轮纹状；培养96 h后，菌落正面呈黑色，菌丝变为黑色，反面呈现部分黄色和部分无色；在显微镜下观察，分生孢子梗透明，顶囊呈球形，分子孢子呈球形，颜色为黑色或无色，结合《发酵饲料生产导图》进行对比，初步确定该菌为黑曲霉。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F001图1菌株形态学观察结果2.2分子生物学鉴定结果以真菌基因组DNA为模板，利用通用引物扩增获得ITS基因的序列，利用NCBI中BLAST搜索，得到匹配度较高的已知序列，利用MEGA软件进行多序列比对，得到黑曲霉系统进化树，见图2。根据NCBI比对结果，菌株1基因序列与已知的Aspergillus niger strain G9、Aspergillus niger strain H1、Aspergillus niger strain ZG7等的相似度达到99%，因此菌株确定为黑曲霉，测序结果已上传国家微生物科学数据中心NMDC，编号为0729。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F002图2黑曲霉系统进化树2.3黑曲霉生长曲线（见图3）由图3可知，0~14 h为黑曲霉生长迟缓期，14~38 h为对数生长期，38 h之后达到稳定生长期。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F003图3黑曲霉生长曲线2.4黑曲霉0729产酶定性结果（见图4）由图4可知，黑曲霉0729产纤维素酶、产淀粉酶、脂肪酶、植酸酶，几乎不产蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F004图4黑曲霉产酶定性结果2.5葡萄糖标准曲线测定结果（见图5）由图5可知，葡萄糖标准曲线拟合方程为y=0.806 7x-0.116 3，R2=0.993 4，线性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F005图5葡萄糖标准曲线2.6不同碳源对黑曲霉0729所产内切葡聚糖酶活的影响（见图6）由图6可知，以木糖为唯一碳源时，黑曲霉0729所产的内切葡聚糖酶活最高，第1 d酶活上升，第2 d急速升高，第3 d急速下降，第4、5 d无酶活。以葡萄糖为唯一碳源时，黑曲霉0729所产内切葡聚糖酶活逐渐上升，第2 d酶活最高，随后逐渐下降。以灭菌CMC-Na为唯一碳源时，黑曲霉0729所产的内切葡聚糖酶活逐渐上升，第5 d酶活最高。以微晶纤维素（MCC）为唯一碳源时，黑曲霉0729所产的内切葡聚糖酶活缓慢上升，第5 d最高。以滤纸为唯一碳源时，酶活逐渐上升，第3 d最高，随后降低；以未灭菌CMC-Na为唯一碳源时，黑曲霉0729所产的内切葡聚糖酶活在1 d最高，第2~3 d急速下降，随后逐渐下降。因此，以木糖作为碳源、在第2 d诱导黑曲霉产内切葡聚糖酶活最高，达到18.70 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F006图6不同碳源对黑曲霉0729所产内切葡聚糖酶活的影响2.7不同碳源对黑曲霉0729所产滤纸酶活的影响（见图7）由图7可知，以木糖为唯一碳源时，黑曲霉0729所产的滤纸酶活最高，第1 d无酶活，第2 d急速升高，第3 d急速下降，第4、5 d无酶活。以葡萄糖为唯一碳源时，黑曲霉0729第1 d不产滤纸酶，第2 d滤纸酶活急速上升，达到最高，第3 d急速下降，随后逐渐下降。以灭菌CMC-Na为唯一碳源时，酶活逐渐上升，第5 d酶活急速上升，达到最高。以微晶纤维素（MCC）为唯一碳源时，滤纸酶活缓慢上升，第5 d最高。以滤纸为唯一碳源时，滤纸酶活逐渐上升，第3 d最高，随后降低。以未灭菌CMC-Na为唯一碳源时，滤纸酶活在第2 d达到最高，第3~5 d急速下降。因此，木糖作为碳源、在第2 d诱导黑曲霉产滤纸酶活最高，达到15.26 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F007图7不同碳源对黑曲霉0729所产滤纸酶活的影响2.8不同碳源对黑曲霉0729所产木聚糖酶活的影响（见图8）由图8可知，以木糖为唯一碳源时，黑曲霉0729第1 d所产木聚糖酶活最高，第1~3 d缓慢下降，第3~5 d急速下降。以葡萄糖为唯一碳源时，黑曲霉0729第1 d产木聚糖酶活最高，第1~2 d酶活急速下降，第2~3 d缓慢下降，后急速下降。以灭菌CMC-Na为唯一碳源时，黑曲霉0729第1 d产木聚糖酶活最高，第1~2 d酶活急速下降，随后缓慢下降。以MCC为唯一碳源时，酶活缓慢上升，第5 d最高。以滤纸为唯一碳源时，酶活从第1~3 d酶活逐渐下降，随后急速下降。以未灭菌CMC-Na为唯一碳源时，木聚糖酶活在第1 d最高，从第1~2 d急速下降，随后逐渐下降。因此，使用滤纸作为碳源、第1 d诱导黑曲霉产木聚糖酶酶活最高，达到19.10 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.015.F008图8不同碳源对黑曲霉0729所产木聚糖酶活的影响3讨论庞春霞等[5]研究发现，在PDA上培养5 d的黑曲霉J7菌落形态呈白色，产黑色孢子，圆形，表面绒毛絮状，与本试验获得菌落的颜色不一样，可能是因为菌种不同。周才碧等[6]研究发现，在察氏琼脂培养基上培养6 d的黑曲霉S6菌落形态较大，圆形，产白色菌丝，黑色孢子，与本试验所观察到的黑曲霉菌落一样，但本试验菌落较小，可能是由于稀释浓度过低或菌种不一样。Toma等[7]研究发现，在PDA上培养4 d的黑曲霉菌落起初是白色，后来变成黑色，菌落背面颜色是淡黄色，与本试验一致，菌落变成黑色的原因主要是存在孢子。菌种是影响发酵的重要因素，菌种的生长阶段直接影响发酵结果[8]。一般发酵过程会在菌种对数生长期进行接种，保证发酵结果的质量和缩短发酵周期，因此需要对菌种的生长进行研究。姜兴粲等[9]测定了黑曲霉的生长曲线，结果显示，接种黑曲霉后至24 h属于迟缓期，24~96 h属于对数生长期，96~110 h属于稳定期，随后进入消亡期，与本试验黑曲霉生长曲线不一致，可能是菌种或是培养基的不同造成。有研究表明，产纤维素酶的菌种的对数生长期不同。如陈少先等[10]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌的对数生长期在2~8 h；姜乃文等[11]研究表明，海洋产纤维素酶草螺菌的对数生长期在13~15 h；王尧悦等[12]研究表明，枯草芽孢杆菌的对数生长期在12~24 h；徐淑琴等[13]研究表明，沙福芽孢杆菌的对数生长期在2~14 h；李君凤等[14]研究表明，粪球肠菌的对数生长期在4~24 h。造成菌种对数生长期不一样的原因可能是菌种、培养基或培养条件不同引起。Ahmed等[15]分离的烟曲霉AKAL1、米曲霉AKAL4、黄曲霉AKAL8和黄曲霉AKAL9的内切葡聚糖酶活均没有超过4 U/mL。Dixit等[16]分离出的黑曲霉MPS25经过优化后的内切葡聚糖酶活为5 U/mL。许颖等[17]将绵羊瘤胃元基因组的内切葡聚糖酶在毕赤酵母GS115表达，发现优化内切葡聚糖酶活达到9.26 U/mL。本试验分离出的黑曲霉的酶活可以达到18.70 U/mL，表明其产内切葡聚糖酶能力较优。王宝腾等[18]分离出黄囊孔菌Flavodon的1种，发现其产滤纸酶活为0.14 U/mL。黄琦琦等[19]通过将蔗渣预处理和将厚垣镰孢霉HML278和米曲霉HML366混合发酵，发现其产滤纸酶活可达7.2 U/mL。刘杰凤等[20]分离出一株耐盐产纤维素酶的黑曲霉，发现其产滤纸酶活为0.75 U/mL。而本试验得到黑曲霉0729产滤纸酶活可达15.26 U/mL，表明产滤纸酶能力优秀。李阳阳等[21]将黑曲霉木聚糖酶在大肠杆菌进行胞外表达，其产木聚糖酶活为15.8 U/mL。袁明贵等[22]将黑曲霉和酵母联合发酵凉茶渣，发现其木聚糖酶活达37.32 U/mL，黑曲霉单独发酵凉茶渣[23]，木聚糖酶活达42.43 U/mL。本试验木聚糖酶活最高为19.1 U/mL，表明本菌株产木聚糖酶能力中等。单糖能够被微生物快速的利用，从而快速促进微生物的定植和生长。单糖还能作为诱导物，结合细胞的某一蛋白，然后该复合物直接或者间接地诱导纤维素酶基因的表达[24-26]，这是木糖和葡萄糖诱导的内切葡聚糖酶活和滤纸酶活会高于多糖组的原因。Kassim等[27]研究表明，滤纸诱导的纤维素酶活最高，纤维二糖和葡萄糖诱导的纤维素酶活很低，与本研究结果不一致，可能是菌种的性质不同或培养方式的不同。滤纸诱导的木聚糖酶活最高，表明结构简单的底物对黑曲霉产纤维素酶的诱导作用不强。罗玲等[28]发现，自制的半纤维素诱导的木聚糖酶活最高，其次是玉米芯粉、麸皮、D-木糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉，表明半纤维素是诱导木聚糖酶活最优碳源。4结论本试验从发酵饲料中筛选分离鉴定能够高效降解纤维素的曲霉菌株，在接种量为5%、温度30 ℃、木糖作为碳源，培养第2 d，黑曲霉诱导产生内切葡聚糖酶活和滤纸酶酶活分别为18.70、15.26 U/mL；滤纸作为碳源，培养1 d对黑曲霉诱导产生木聚糖酶活为19.10 U/mL。