酵母作为酿酒工业中的主要副产品，其价格低廉、来源充足，含有大量的生物活性物质，如核苷酸、多肽、多糖、维生素、矿物质、促生长因子、抗氧化活性物质等[1-3]。研究表明，在水产饲料中使用酵母产品，能够提高水产动物的消化、吸收能力，调节免疫反应，改善动物健康状况，从而提高水产动物的生长性能和抗菌能力[4-6]。在饲料中添加酵母产品能够有效改善养殖水体环境[7]。但酵母细胞的细胞壁很厚，营养物质很难释放出来，导致动物对酵母的利用率很低[8-9]。因此，从副产品中提取高价值的营养物质——酵母提取物（YE）作为功能性饲料添加剂使用，不仅能够产生更多的经济价值，而且有利于环境保护[10-11]。研究发现，饲料中添加YE能够提高多种水产动物的生长性能、抗氧化和免疫能力，促进性腺发育[12-14]，但是其中的作用机制尚不清晰。YE的抗应激和抗氧化作用仍需进一步研究。大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗名加州鲈鱼，隶属鲈形目（Perciformes），太阳鱼科（Centrarchidae），黑鲈属（Micropterus）。大口黑鲈生长迅速、肉质鲜美、营养价值高，是我国重要的经济水产养殖种类[15]。大口黑鲈为典型肉食性淡水鱼类，养殖生产过程中需要消耗大量的鲜杂鱼或富含高鱼粉高鱼油的配合饲料。随着规模化和集约化养殖的发展，养殖密度过大、水质环境不佳等导致环境中应激因素增加，造成养殖动物的氧化应激[16]。氧化应激状态下，由活性氧（ROS）积累引发的细胞氧化损伤将降低机体的抗氧化和免疫能力，并引发大规模病害，最终影响大口黑鲈养殖业的健康发展。因此，本试验以大口黑鲈幼鱼为对象，研究饲料中添加YE对其生长性能、饲料利用、消化、抗氧化和免疫力的影响，为YE在水产动物养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验饲料以鱼粉、大豆浓缩白和豆粕等为蛋白源，以豆油、鱼油和卵磷脂等为脂肪源，纤维素为填充剂，参考文献[17]至文献[19]，设计粗蛋白水平约49%、粗脂肪水平约11%的4组等氮等脂饲料，CON组、YE2组、YE4组、YE6组饲料中YE的添加水平分别为0、2 000、4 000、6 000 mg/kg。基础饲料组成及营养水平见表1。将固体原料粉碎，过60目筛，按照配方称取原料并混合均匀，将脂肪原料及水加入固体原料中再次混合至均匀，使用双螺杆挤条机制作粒径为2.5 mm、长度为5 mm的颗粒饲料。饲料经过30 min的熟化，置于阴凉处，风干至水分含量约为10%，于-20 ℃冰箱密封保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.T001表1基础饲料组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量营养水平合计100.00鱼粉40.00水分11.80大豆浓缩蛋白17.00粗蛋白49.35面粉15.00粗脂肪10.89豆粕12.00灰分8.85豆油3.35鱼油3.35大豆卵磷脂1.00维生素预混料1.00矿物质预混料1.00氯化胆碱0.50VC磷酸酯0.10磷酸二氢钙1.50纤维素4.20注：1.每千克维生素预混料为饲料提供：VA 400 000 IU、VB1 800 mg、VB2 1 600 mg、VB6 1 200 mg、VB12 4 mg、VC 35 000 mg、VD3 80 000 IU、VE 16 000 mg、VK3 40 mg、生物素600 mg、烟酸3 800 mg、D-泛酸钙2 500 mg、肌醇4 000 mg、叶酸320 mg。2.每千克矿物质预混料为饲料提供：镁3 000 mg、铁1 800 mg、锰800 mg、碘250 mg、铜350 mg、锌 6500 mg、硒15 mg、钴60 mg。3.营养水平均为实测值。%饲料原料购自福建天马科技集团股份有限公司，饲料中的常规营养成分参照AOAC[20]的方法进行检测分析。其中，水分含量采用105 ℃常压干燥法测定，粗蛋白质含量采用Kjeltec 8400型凯氏定氮仪测定，粗脂肪含量采用索氏抽提仪测定，灰分采用马弗炉550 ℃灼烧法测定。1.2养殖管理试验用大口黑鲈幼鱼购自福建天马科技集团股份有限公司福清养殖基地，在福建农林大学海洋学院的试验基地中暂养驯化2 w。随机挑选规格一致、初重为（14.05±0.28）g的健康幼鱼360尾，分为4组，每组3个重复，每个重复30尾，随机分配到12个300 L的循环水养殖桶中。养殖期间，每天7：30和17：30进行投喂至幼鱼达到饱食状态，并于投喂0.5 h后，采用虹吸法收集残饵和粪便，其中残饵以重复为单位进行收集，烘干，称重。养殖试验持续60 d，在此期间观察和记录试验鱼的摄食行为以及水质情况，及时捞出死鱼。养殖水温为（27±0.5）℃，pH值为7.5~7.7，溶氧量大于5 mg/L，氨氮含量小于0.15 mg/L。1.3样品采集试验第60 d时，禁食24 h。记录每个重复中大口黑鲈的数量和总重，用于计算增重率（WG）、特定生长率（SGR）、成活率（SR）、饲料效率（FE）和蛋白质效率（PER）。大口黑鲈采用10 mg/L的MS-222麻醉后，每个重复取3尾鱼，分别测量体长，称量体重，解剖获取肝脏和内脏团并分别称重，用于计算鱼体的肥满度（CF）、肝体比（HSI）和脏体比（VSI）。每个重复取3尾鱼的前肠，置于4%的多聚甲醛溶液中固定，用于分析肠道形态指标。另取6尾鱼的肠道，使用液氮速冻后于-80 ℃保存，用于测定酶活和基因表达量。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能生长性能按照如下公式进行计算。WG=(末重-初重)/初重×100%(1)SGR=(ln末重-ln初重)/养殖天数×100%(2)FE=(末重-初重)/摄食量(3)PER=(末重-初重)/蛋白质摄入量(4)SR=终尾数/初尾数×100%(5)CF=100×体重/体长3 (6)HSI=肝脏重/体重×100%(7)VSI=脏体重/体重×100%(8)1.4.2肠道形态新鲜肠道组织在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，在通风橱进行适当修剪，并在75%~100%浓度递增的乙醇中脱水。之后，将样品嵌入到石蜡中包埋，并使用切片机切成4 μm的薄片，接着用苏木精和伊红染色[21]，并在显微镜（HistoCore AUTOCUT，徕卡，德国）下获取图像。利用ImagePro Plus6.0软件测量肌层厚度（MT）、绒毛高度（VH）和绒毛宽度（VW）。1.4.3肠道酶活性将肠道组织以1∶9的比例与生理盐水在冰上混合并匀浆，在4 ℃、2 500 r/min条件下离心10 min，获得上清液，用于测定消化酶（淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）的含量。以上指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，方法按照说明书进行。1.4.4总RNA提取和实时荧光定量PCR（qPCR）肠道样品的总RNA采用RNA提取试剂盒（翌圣生物科技有限公司）提取，RNA的质量通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，浓度则通过分光光度法（Nanodrop 2000，Thermo Fisher Scientific）测定。cDNA通过反转录试剂盒Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（翌圣生物科技有限公司）合成。经过稳定性比较后，本试验选择ef1-α作为管家基因。采用Primer Premier 5.0 软件设计目标基因（HSP70、IL-1β、IL-8、IL-10、IL-15、TGF-β、TNF-α和TOR）的特异性引物（见表2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.T002表2qPCR引物基因引物序列（5'→3'）长度/bp基因序列号EF-1αF-GGCTGGTATCTCCAAGAACGR-GTCTCCAGCATGTTGTCWCC239KT827794HSP70F-CAGTGATGAAGACAAGCAGAAGAR-GCCACCAGCACTCTGATACA163XM_038694198IL-1βF-CGTGACTGACAGCAAAAAGAGGR-GATGCCCAGAGCCACAGTTC166XM_038733429.1IL-8F-CGTTGAACAGACTGGGAGAGATGR-AGTGGGATGGCTTCATTATCTTGT112MW751832.1IL-10F-CGGCACAGAAATCCCAGAGCR-CAGCAGGCTCACAAAATAAACATCT119XM_038696252.1IL-15F-AGCGTCAGATTTCTCAATGGTGTR-CGTGACTGACAGCAAAAAGAGG82XM_038693989.1TGF-βF-GCTCAAAGAGAGCGAGGATGR-TCCTCTACCATTCGCAATCC118XM_038693206.1TNF-αF-CTTCGTCTACAGCCAGGCATCGR-TTTGGCACACCGACCTCACC161XM_038710731.1TORF-TCAGGACCTCTTCTCATTGGR-CCTCTCCCACCATGTTTCTCT132XM_038723321.1注：EF-1α为延长因子1-α，HSP70为热休克蛋白70，IL为白细胞介素，TGF-β为转化生长因子-β，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，TOR为雷帕霉素靶蛋白。qPCR在荧光定量PCR仪（Lightcycler 96，Roche, Switzerland）上反应，其总体系为20 μL，包括0.4 μL上下游引物，10 μL 2×SYBR Green Master（翌圣生物科技有限公司），0.8 μL cDNA和8.4 μL DEPC水。反应程序为95 ℃ 2 min，45个循环的95 ℃ 10 s、58 ℃ 10 s和72 ℃ 20 s。程序结束后，采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达水平[22]。1.5数据统计与分析采用SPSS 22软件对数据进行单因素方差分析，若存在显著差异，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲料中YE水平对大口黑鲈幼鱼生长性能的影响（见表3）由表3可知，各组大口黑鲈的SR均大于90%，且各组之间差异不显著（P0.05）。YE6组大口黑鲈WG和SGR显著高于CON组（P0.05），FE和PER显著高于CON组和YE2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.T003表3饲料中YE水平对大口黑鲈幼鱼生长性能的影响项目CON组YE2组YE4组YE6组初重/g14.02±0.3113.65±0.7113.60±0.6714.93±0.35末重/g55.99±2.6856.87±1.7357.96±3.6065.29±2.83WG/%298.99±10.31b317.62±9.68ab325.67±9.54ab336.80±8.79aSGR/(%/d)2.31±0.04b2.38±0.04ab2.41±0.04ab2.46±0.03aSR/%96.67±1.9294.44±2.9493.33±0.0093.33±3.33FE1.06±0.03b1.08±0.07b1.18±0.03ab1.24±0.02aPER2.15±0.06b2.19±0.14b2.41±0.05ab2.49±0.05aCF/(g/cm3)2.19±0.082.18±0.082.21±0.042.17±0.06HSI/%2.25±0.042.20±0.072.22±0.022.27±0.08VSI/%8.66±0.098.65±0.168.65±0.088.72±0.11注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2饲料中YE水平对大口黑鲈幼鱼肠道酶活性的影响（见表4）由表4可知，YE4组和YE6组大口黑鲈肠道中蛋白酶和SOD活性显著高于CON组与YE2组（P0.05）。各YE组大口黑鲈肠道脂肪酶活性均显著高于CON组（P0.05）。大口黑鲈肠道GSH-Px活性随饲料中YE水平的增加呈现先升高后降低的趋势，在YE4组达到最高，且显著高于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.T004表4饲料中YE水平对大口黑鲈幼鱼肠道酶活性的影响组别蛋白酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)淀粉酶/(U/g prot)SOD/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)CON组5.32±0.15b9.33±0.37b1.99±0.0985.91±2.47b218.41±9.15b1.78±0.11YE2组5.67±0.19b11.39±0.22a2.22±0.1991.56±3.90b244.60±9.07ab1.97±0.13YE4组8.46±0.10a11.46±0.36a2.28±0.16110.08±3.04a265.61±9.59a1.85±0.08YE6组8.35±0.25a11.09±0.33a2.38±0.11122.22±5.18a243.04±4.80ab1.94±0.11注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.3饲料中YE水平对大口黑鲈前肠形态的影响（见图1、图2）由图1、图2可知，饲料中添加YE水平对大口黑鲈前肠的VW无显著影响（P0.05）。YE6组的大口黑鲈前肠的MT和VH显著高于CON组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.F001图1各组大口黑鲈肠道形态（50×）图2饲料中YE水平对大口黑鲈前肠形态的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.F2a1（a）肌层厚度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.F2a2（b）绒毛高度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.F2a3（c）绒毛宽度2.4饲料中YE水平对大口黑鲈肠道免疫相关基因的影响（见图3）由图3可知，饲料中YE水平对大口黑鲈肠道中IL-8的表达量无显著影响（P0.05），YE4组、YE6组大口黑鲈肠道中IL-1β、IL-15和TNF-α的表达量显著低于CON组（P0.05）。各YE组大口黑鲈肠道中TGF-β和TOR的表达量显著高于CON组（P0.05）。YE2组、YE4组大口黑鲈肠道中的IL-10与HSP70表达量显著高于CON组（P0.05），显著低于YE6组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.007.F003图3饲料中YE水平对大口黑鲈肠道免疫相关基因的影响3讨论3.1饲料中添加YE对大口黑鲈生长性能的影响研究表明，饲料中添加YE能够提高水产动物的生长性能，如尼罗罗非鱼[12]（Oreochromis niloticus L.）、梭鲈[13]（Sander lucioperca L.）、草鱼[23]（Ctenopharyngodon idellus）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[8,24]和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）[25]等。本试验发现，YE能够提高大口黑鲈的生长性能与，与以上结果相似。研究表明，在鲤鱼（Cyprinus carpio）饲料中添加0~2 000 mg/kg YE可显著提高鲤鱼的生长性能和饲料利用率[26]；饲料中YE水平在80 000 mg/kg以下时，罗非鱼的生长性能和摄食量与YE水平呈正相关[12]；饲料中YE水平在10 000~20 000 mg/kg之间时，凡纳滨对虾的生长性能和饲料效率最高[8]。另有研究表明，罗非鱼（O. niloticus♀× O. aureus）的WG随着饲料中YE水平的增加呈现先升高后降低的趋势[27]，在6 000 mg/kg时最高。本试验中，大口黑鲈的WG和SGR随饲料中YE含量的增加而增加，且YE6组显著高于CON组，表明饲料中添加6 000 mg/kg的YE最适合大口黑鲈的生长。这与之前的研究结果略有不同，可能是由动物种类、生长阶段、酵母来源和种类、添加水平、饲料原料的不同所导致[8]。本试验中，随着饲料中YE水平的增加，大口黑鲈FE和PER与WG和SGR的变化趋势相似，说明生长性能提高的原因可能是YE提高了大口黑鲈对饲料的利用率，增加了肠道对营养物质的吸收。3.2饲料中添加YE对大口黑鲈肠道形态与消化吸收的影响肠道是鱼类消化和吸收营养的主要位置，其结构的完整性至关重要。肠道的吸收能力也可以通过VH、VW和MT等形态学指标来反映。肠道绒毛高度和数量增加意味着消化道吸收面积增大，因此营养吸收能力得到提高[28]。另外，肠道中的消化酶可以将摄入的大量营养物质分解为能够被水生动物吸收的物质，消化酶活性能够反映肠道的消化能力[29-31]。研究表明，YE中富含的核苷酸能够增强代谢酶活性，利于机体合成激素和酶等活性物质[32]，增强肠道消化吸收营养物质的能力[33]；YE中丰富的细胞壁多糖含量能够完善和稳定肠道结构[1]。本研究中，各组大口黑鲈前肠的结构均完整，但是YE6组大口黑鲈前肠MT和VH显著高于CON组；YE组饲料能够显著提高大口黑鲈肠道脂肪酶活性；YE4组和YE6组大口黑鲈肠道蛋白酶的活性显著高于另外两组。结果表明，YE能够进一步提高肠道的稳定性，增加吸收面积，提高大口黑鲈对脂肪和蛋白质的消化、吸收能力，进而提高其饲料利用率和生长性能。与前人在罗非鱼（Oreochromis niloticus）[34]、建鲤（C. carpio var. Jian）[3]和海鲈（Dicentrarchus labrax）[35]的研究结果相似。3.3饲料中添加YE对大口黑鲈肠道抗氧化能力的影响肠道的消化吸收能力受到健康状态的影响。机体ROS的形成和抗氧化之间的不平衡将导致氧化应激[36]，ROS通过过氧化氢的分解产物导致MDA和其他脂质过氧化物的积累。MDA是反映出机体氧化应激水平的标志物，其含量可以评估组织的损伤水平[17]。本研究中，各组大口黑鲈肠道MDA含量无显著差异，表明摄食不同的试验大口黑鲈中不存在氧化应激。抗氧化防御系统通过消除多余的ROS改善机体的健康状态，而SOD和GSH-Px是酶促抗氧化系统的基本成分。SOD可将O2-转化为H2O2，GSH-Px则催化谷胱甘肽过氧化氢转化为H2O。研究表明，YE能够提高水产动物的抗氧化能力[27,37-38]。本研究中，YE4组和YE6组大口黑鲈肠道SOD活性高于其他两组，YE4组大口黑鲈肠道GSH-Px活性显著高于CON组，YE饲料能够显著提高大口黑鲈肠道HSP70的基因表达量，YE6组中的表达量最高。HSP70蛋白在氧化应激时能够保护机体免受ROS的影响[17]。本试验表明，饲料中添加4 000、6 000 mg/kg的YE能够提高大口黑鲈肠道的抗氧化能力，提高机体的抗氧化应激能力。3.4饲料中添加YE对大口黑鲈免疫力的影响研究表明，氧化应激与动物的免疫反应密切相关，通常持续的氧化应激会触发炎症反应，从而引起各种疾病[39-40]。除了抗氧化能力，炎症反应还主要受细胞因子（促炎因子和抑炎因子）的分泌调节[41]。IL-1β、IL-8、IL-15和TNF-α是重要的促炎因子，IL-10和TGF-β则是抑炎因子。本试验中，与对照组相比，YE组饲料提高了大口黑鲈肠道中IL-10和TGF-β的表达量，降低了IL-1β、IL-15和TNF-α的表达量，表明YE能够提高大口黑鲈肠道的抗炎能力，提高免疫力和健康状态。研究表明，YE同样能够提高建鲤[3]和凡纳滨对虾[24,42]的免疫能力。此外，HSP70蛋白在抗氧化和免疫应答中均起着重要作用，其表达量与抑炎反应呈现正相关[43-44]，本试验中，YE6组大口黑鲈肠道中HSP70的表达量最高；YE组大口黑鲈肠道中TOR基因表达量显著高于CON组，可能是因为TOR通路能够促进抑炎因子的分泌[45]。综上所述，YE可能通过激活TOR通路促进抑炎因子的分泌，同时抑制促炎因子的分泌，从而提高大口黑鲈肠道的免疫能力。另外，TOR信号通路对细胞生存、生长、增殖和凋亡以及蛋白质合成和降解至关重要[46]。TOR信号通激活能够促进蛋白质的合成。因此TOR的高表达也可能是YE提高大口黑鲈生长性能的重要原因。4结论本试验结果表明，饲料中添加6 000 mg/kg YE能够提高大口黑鲈肠道的免疫和抗氧化能力，提高肠道的吸收面积和消化酶活性，进而提高饲料利用率和生长性能。