由于饲料原料价格上涨，寻找促进畜禽生产以及研发使用地源性饲料刻不容缓。发酵可提高粗蛋白水平、降低粗纤维水平。发酵饲料可将饲料中的多糖、抗营养因子（ANF）等不易被畜禽机体消化吸收的物质分解和转化为可被消化吸收利用的物质，提高营养生物利用率，能降低饲料成本，改善饲料的营养价值[1-2]。研究表明，发酵饲料可提高肉鸡的平均日增重以及饲料转化率[3]。近年来，饲喂方式对动物机体健康的研究正逐步增多，De La Guardia-Hidrogo等[4]发现，摄食频率可以使奶牛的瘤胃微生物菌群产生昼夜波动。进食速率也会影响育肥猪的采食量和生长性能，从而影响胴体品质[5]。饲喂频率对猪的采食量以及氮素利用也有影响[6]。也有研究显示，不同饲喂方式对羊的采食量、体重、日增重等生长性能以及营养物质的消化率具有影响[7-8]。不同饲喂方式饲喂乳酸菌对肉鸡的料重比、肠道形态及菌群也具有显著影响[9]。因此，饲喂方式以及饲喂频率的改变可能会影响动物的养分摄入方式，进而影响机体对蛋白质、脂质等养分的消化、吸收、利用[4]。发酵饲料的研究多以不同浓度梯度相同方式饲喂蛋鸡，不同饲喂方式对蛋鸡机体健康是否存在影响的研究较少。研究表明，家禽饲喂6%以上的发酵饲料可以改善肠道形态，改变肠道菌群组成，提高菌群群丰富度，进而改善肠道健康，提高生产性能[10-12]。本试验添加10%的发酵饲料，研究不同饲喂方式对蛋鸡的生产性能、肠道形态以及微生物菌群的影响，为发酵饲料在蛋鸡养殖中的应用提供新的饲喂思路。1材料与方法1.1试验设计与饲养管理试验在广西富凤蛋鸡场进行。选取23周龄广西麻鸡蛋鸡480羽，随机分为4组，每组6个重复，每个重复20羽。对照组（con组）蛋鸡饲喂基础饲粮；试验组为间歇性饲喂（以周为单位），G1组全期饲喂发酵饲料；G2组5 d饲喂发酵饲料，2 d饲喂基础日粮；G3组2 d饲喂发酵饲料，5 d饲喂基础日粮。预试期7 d，正式试验期56 d。蛋鸡自由采食，充足饮水，按正常免疫程序进行免疫接种。三层阶梯笼养，同处理组在上、中、下三层均匀分布。乳头饮水器自由饮水，自由采食，室温为22~25 ℃；光照周期16 h/d。饲养期间定期消毒并保持舍内自然通风。1.2试验日粮基础饲粮参照NRC（1996）标准与生产实践需要配制的粉状配合饲料，基础饲粮组成及营养水平见表1。发酵饲料复合益生菌菌粉购自山东某生物工程公司，以玉米、豆粕、棉粕、麸皮等饲料原料作为发酵底物，将复合益生菌（枯草芽孢杆菌≥2×109 CFU/g、乳酸杆菌≥1×109 CFU/g、酵母菌活菌数≥4×108 CFU/g）按发酵底物的0.2%添加，将混合好的原料和发酵菌液充分混匀，装入发酵罐中，37 ℃下进行发酵，发酵72 h左右。发酵完成后将饲料取出进行干燥，以控制水分含量为12%~14%，包装，贮存，以便后续使用（由广西某农牧饲料有限公司提供）。饲料发酵前后的营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米61.25代谢能/(MJ/kg)13.98豆粕25.00粗蛋白/%16.20小麦麸2.50粗纤维/%4.05石粉7.25钙/%1.42磷酸氢钙1.40磷/%0.38赖氨酸0.20蛋氨酸0.10食盐0.30预混料2.00注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 8 000 IU、VB1 4 mg、VB2 3.6 mg、VB5 40 mg、VB6 4 mg、VB12 0.02 mg、VD3 3 000 IU、VE 20 IU、VK3 2 mg、生物素0.15 mg、叶酸1.0 mg、D-泛酸11 mg、烟酸10 mg、抗氧化剂100 mg、Cu 10 mg、Fe 80 mg、Mn 80 mg、Zn 75 mg、I 0.40 mg、Se 0.30 mg。2.营养水平均为实测值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.T002表2饲料发酵前后营养水平（风干基础）项目发酵前发酵后pH值5.98±0.694.32±0.38粗蛋白质16.20±6.8716.32±5.23粗纤维4.05±0.023.98±0.02钙1.42±0.021.38±0.01磷0.38±0.010.40±0.01赖氨酸0.28±0.030.29±0.01蛋氨酸0.19±0.050.21±0.02%1.3测定指标及方法1.3.1生产性能试验期间每天记录蛋鸡产蛋数量、总蛋重、不合格蛋数等，计算各组的产蛋率、平均蛋重、合格蛋率、料蛋比。产蛋率＝[总产蛋数/(鸡数×天数)]×100%(1)平均蛋重＝总蛋重/总产蛋数(2)平均日采食量＝总采食量/(鸡数×天数)(3)料蛋比＝总采食量/总蛋重(4)蛋合格率＝合格蛋数/产蛋数×100%(5)1.3.2肠道形态试验结束前，蛋鸡空腹12 h，每个重复选取1只体况接近的蛋鸡，选取每个肠段同一位置的十二指肠、空肠、回肠各1 cm左右，生理盐水冲洗，常温固定保存在4%多聚甲醛中，进行切片制作，苏木精-伊红（HE）染色，显微镜镜检，测定绒毛长度以及隐窝深度，计算绒毛长度/隐窝深度（V/C）值。1.3.3盲肠菌群16S rRNA测定试验结束前，蛋鸡空腹12 h，每个重复选取1只体况接近的蛋鸡，采用无菌的冻存管收取盲肠内容物并放入液氮中进行冻存。使用保存好的盲肠样品中内容物，根据Qiagen试剂盒提取DNA；利用Thermo NanoDrop2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检；选择V3-V4区，用通用引物为F341和R806设计并合成引物并进行PCR扩增和产物的纯化，使用Qubit进行文库定量，并根据每个样品的数据量要求，进行相应比例的混合；使用Illumina Miseq平台进行上机测序（送样至上海美吉生物有限公司委托测序），通过其云平台进行生物信息学分析。1.4数据统计与分析采用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析，采用LSD法和SNK法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡生产性能的影响（见表3）由表3可知，5~8 w，G1组合格蛋率极显著高于其他各组（P0.01），1~4 w平均蛋重均极显著高于其他各组（P0.01）；5~8 w，G2组产蛋率、平均蛋重和合格蛋率均高于con组（P0.05）。与con组相比，5~8 w，G1组、G2组平均蛋重分别提高了3.04%、1.10%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.T003表3不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡生产性能的影响项目时间/wcon组G1组G2组G3组P值平均日采食量/[g/(只·d)]1～4117.67±8.45118.29±6.44117.35±10.71117.83±10.710.4555～8120.07±8.45121.29±7.34121.35±8.65121.32±11.340.227产蛋率/%1～474.69±5.2676.15±5.1574.85±6.2873.29±4.180.3375～873.19±4.7574.93±4.3473.94±3.2473.55±4.130.566平均蛋重/(g/枚)1～447.21±0.62B47.83±0.68A46.97±0.82B46.91±1.05B0.0015～848.05±0.6849.51±0.7148.58±2.1947.90±3.530.084合格蛋率/%1～497.49±1.56B98.04±1.58A96.72±1.60B96.60±1.64B0.0095～896.45±2.91B98.20±1.36A96.95±0.87B95.95±2.67B0.004料蛋比1～42.76±0.282.71±0.312.81±0.332.87±0.310.3905～83.36±0.443.23±0.213.35±0.223.43±0.320.549注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.2不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道形态的影响（见表4）由表4可知，G2组蛋鸡空肠绒毛高度极显著高于其他组（P0.01），空肠绒毛高度/隐窝深度极显著高于con组（P0.01）；G3组蛋鸡空肠隐窝深度以及G1组蛋鸡的回肠隐窝深度均极显著低于con组（P0.01），G1组蛋鸡十二指肠和回肠绒毛高度/隐窝深度均显著高于con组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.T004表4不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道形态的影响项目con组G1组G2组G3组P值十二指肠绒毛高度/μm1 285.32±78.651 352.68±68.541 342.25±112.051 293.17±109.850.058隐窝深度/μm260.26±13.25230.12±12.85220.56±15.85236.58±18.980.170绒毛高度/隐窝深度5.98±0.51b7.62±0.63a5.68±0.93b6.71±0.58a0.013空肠绒毛高度/μm1 071.87±68.71B1 112.61±80.50B1 614.57±72.47A1 094.57±299.99B0.001隐窝深度/μm182.64±9.17A183.17±11.08A169.74±12.21AB153.18±21.24B0.001绒毛高度/隐窝深度5.88±0.47B6.10±0.75AB9.52±0.51A7.13±1.64AB0.001回肠绒毛高度/μm951.87±46.15923.36±74.35873.80±54.78932.83±148.560.058隐窝深度/μm160.07±14.71A125.98±9.32B154.30±17.01A138.87±17.44B0.001绒毛高度/隐窝深度5.98±0.51b7.62±0.63a5.68±0.93b6.71±0.58a0.0132.3不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道菌群的影响2.3.1不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道菌群α多样性的影响（见表5）由表5可知，各组样品测序覆盖率在99.9%以上，表明测序深度已经基本覆盖样品中所有物种。各组样品测序获得的肠道菌群的Sobs指数、Shannon指数、Simpson指数、Ace指数、Chao指数差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.T005表5不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道菌群α多样性的影响项目覆盖率/%Sobs指数Shannon指数Simpson指数Ace指数Chao指数P值0.7980.4490.5180.1660.1380.277con组99.99±0.0515.00±1.411.01±0.170.46±0.0516.69±1.4715.25±0.95G1组100.00±0.0315.75±0.500.97±0.120.47±0.0316.21±0.2515.83±0.33G2组100.00±0.0314.75±0.950.89±0.070.52±0.0115.24±0.7314.87±0.85G3组100.00±0.0415.00±0.000.92±0.020.46±0.0515.46±0.6515.12±0.252.3.2OTU比较结果（见图1）由图1可知，con组、G1组、G2组、G3组的OTUs个数分别是802、905、860、879个。从相交程度来看，4组共有676个相同的OTUs，con组、G1组、G2组、G3组特有的OTUs为8、34、13、19个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F001图1OTU比较结果2.3.3不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道门水平上菌群相对丰度的影响（见图2）由图2可知，门水平上拟杆菌门（Bacteroides）、厚壁菌门（Firmicutes）占据绝对优势，占比达95%以上；随着拟杆菌门相对丰度的降低，厚壁菌门所占比例相应提升，但各组菌门间相对丰度差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F002图2门水平上菌群物种的分布2.3.4不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道属水平上菌群相对丰度的影响（见图3~图5）由图3可知，属水平上各组的优势菌属均为拟杆菌（Bacteroides）、理研菌属（Rikenellaceae_RC9_gut_group）和乳酸杆菌（Lactobacillus），其中G1组理研菌属的丰富度高于各组，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F003图3属水平上菌群物种的分布多组检验采用Kruskal-Wallis H test，结果见图4。图4对照组与试验组属水平上菌群物种的分布差异10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F4a1（a）对照组与试验组属水平差异分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F4a2（b）试验组属水平差异分析由图4可知，各组间在巴内西埃拉菌属（Barnesiella）、哈利氏真杆菌属（Eubacterium_hallii_group）等在属水平上差异显著（P0.05）；试验组间也在丁酸梭菌属（Butyricimonas）、毛螺菌属（Lachnospiraceae_FCS020_group）等5种属水平上差异显著（P0.05）。两组检验采用Welch's t-test差异分析，结果见图5。由图5可知，发酵饲料不同饲喂方式下肠道菌群在属水平上均有显著差异（P0.05）。图5试验组属水平上菌群物种的分布差异10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F5a1（a）G1组与G2组属水平差异分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F5a2（b）G1组与G3组属水平差异分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F5a3（c）G2组与G3组属水平差异分析2.3.5蛋鸡肠道菌群与鸡生产性能Spearman相关性分析（见图6）由图6可知，对属分类水平丰富度差异菌群进行生物学途径的Spearman相关分析，横向表示环境因子信息，纵向表示丰富度差异菌群。由图6可知，哈利氏真杆菌属相对丰富度与蛋重显著负相关，与合格蛋率显著正相关。丁酸单胞菌属与合格蛋率极显著正相关，表明发酵饲料不同的饲喂方式下对肠道菌群属水平相对丰度有一定影响，且与生产性能有一定的相关性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.20.007.F006图6肠道菌群与生产性能Spearman相关性分析注：“*”表示影响显著（P0.05），“**”表示影响极显著（P0.01）。3讨论3.1不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡生产性能的影响研究表明，添加生物发酵饲料可使育肥猪平均日增重和平均日采食量提高10.89%和5.86%[13]、料重比显著降低[14]。曹山川等[15]研究发现，不同饲喂方式对猪的平均日采食量和料重比具有一定影响。本试验中，G3组鸡蛋的蛋重以及合格蛋率与对照组相比有降低趋势，可能由于试验期较短且发酵饲料添加量较低，产生肠道应激降低蛋重以及合格蛋率。G1组鸡蛋的合格蛋率、平均蛋重高于其他各组，原因可能是发酵饲料对肠道健康具有积极作用，能够降低胃肠pH值和致病微生物活性，增加短链脂肪酸含量，提高饲料消化率，减少由于间隔饲喂对的肠道的影响，从而提高了蛋鸡生产性能。3.2不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道形态的影响肠道是动物消化以及吸收营养物质的重要场所。Peng等[16]在日粮中添加发酵饲料可提高肉鸡肠道绒毛高度、十二指肠绒毛高度/隐窝深度。Liu等[11]发现，添加6%以上的发酵混合饲料降低了蛋鸡隐窝深度，增加绒毛高度/隐窝深度。常玲玲等[17]研究表明，不同饲喂方式对乳鸽肠道消化吸收具有明显的差异影响。本研究中，试验组肠道的绒毛高度/隐窝深度高于对照组，表明发酵饲料能够有效改善肠道形态。发酵饲料可以通过增加肠道内有益菌数量以及有益菌在肠道的富集、降低饲料ANFs含量、增加饲料中小肽等易消化物质含量等方式共同作用。同时，动物机体对营养物质消化吸收具有一定节律性[18]，长时间的间隔饲喂实现生物钟重置，从而使机体细胞组织器官的各种功能活动、消化代谢等达到最佳状态，使机体各阶段能量代谢稳态平衡。3.3不同饲喂方式下发酵饲料对蛋鸡肠道菌群的影响大量研究已将肠道微生物群丰富性和多样性与改善机体健康和生产性能建立起联系[19-21]。Hua等[22]研究表明，不同的饲喂频率会影响后备母猪肠道微生物菌群，进而影响肠道代谢物中短链脂肪酸的浓度。Li等[23]、曹山川等[15]发现，不同喂养方式节奏的改变会影响肠道微菌群的相对丰富度。本试验结果表明，在门水平上，拟杆菌门、厚壁菌门为优势菌群，与张波等[24]的结果一致。拟杆菌门、厚壁菌门能够抵抗外来细菌定植，在能量的产生和代谢中起重要作用。在属水平上，拟杆菌、理研菌属和乳酸杆菌是优势菌属，占蛋鸡总菌属的近50%，拟杆菌是一个重要的厌氧属，负责分解肠道生态系统中的多糖[25]。拟杆菌分解多糖产生有机酸，降低肠道pH值，利于有益菌在肠道中的定植。理研菌属与黏蛋白降解细菌有关，同时也与机体的脂代谢相关[26]。本研究中，随着拟杆菌门相对丰度的降低，厚壁菌门所占比例相应提升，发酵饲料中含有的有机酸可降低肠道pH值，并通过竞争排斥、抑制细菌素的产生、降解细菌阻止肠道病原体定植。属水平上，不同的饲喂方式下对肠道菌群丰富度存在显著性差异，哈利氏真杆菌属能够利用葡萄糖合成丁酸，其可使近结肠端PhIP（2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑[4, 5-b]吡啶）的转化提高了300倍，远结肠端也可提升120倍，减少机体对有害物质的吸收[27]。对生产性能进行Spearman分析可知，差异菌群与生产性能存在一定的相关性，丁酸梭菌属与合格蛋率极显著正相关，丁酸梭菌属与甘油三酯水平降低密切相关[28]，降低蛋鸡体内甘油三酯水平，维持蛋鸡机体健康，提高蛋鸡合格蛋率等生产性能。4结论本试验条件下，发酵饲料饲喂时间越长，蛋鸡产蛋性能及肠道发育更佳，建议全期饲喂。