鸡肠道菌群由厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌等组成。不同日龄、不同肠段中的微生物组成存在较大差异。成熟的微生物群高度多样化，微生物种类超过1 000种[1]。胃肠道微生物可分为两类：一类是共生微生物，长期寄居在胃肠道，称为正常菌群或正常微生物群；另一类是暂时性和潜在的病原体，如大肠杆菌、弯曲杆菌等[2]。肠道微生物菌群对鸡的消化系统生理、生产性能、免疫系统和病原体排除等具有重要作用[3]。正常微生物群作为适应宿主环境的共生菌，参与鸡的多种代谢、营养物质消化吸收和免疫系统发育，通过发酵、消化等过程消化饲料中淀粉、纤维素等宿主难以消化吸收的物质，产生乙酸、丁酸和琥珀酸，向宿主提供维生素、氨基酸和短链脂肪酸[4]。通过影响黏膜分泌免疫球蛋白、非特异性免疫、免疫应答等过程，提高机体健康状况或生产性能[5]。罗雯等[6]利用高通量测序技术比较10周龄不同体质量宁都黄鸡的肠道微生物结构，发现组间盲肠微生物群落组成相似但菌群相对丰度差异显著；与肉鸡体质量正相关的是甲烷短杆菌属和粪杆菌属，负相关的是脱硫弧菌属和互养菌属。张亚楠等[7]通过16S rDNA基因高通量测序，发现海兰褐壳蛋鸡不同产蛋水平的肠道微生物具有共同优势菌群，即厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门；不同产蛋水平肠道微生物主要差异菌属是乳酸杆菌属，推测乳酸杆菌属占比与产蛋水平存在关联。杨曾乔等[8]发现，肉种鸡高产蛋率盲肠厚壁菌门和乳酸杆菌属相对丰度显著升高，拟杆菌门和螺旋体门相对丰度显著降低。本试验前期比较散养和笼养庄河大骨鸡12、18周龄盲肠微生物组成差异[9]。研究通过16S rDNA高通量测序方法分析高、中和低产蛋水平的粪便微生物组成，为后续研发大骨鸡的微生态添加剂，通过菌群调节产蛋性能提供参考。1材料与方法1.1试验用鸡分组及采样选取锦州医科大学科研试验场F6代体质量相近的180日龄产蛋庄河大骨鸡，单笼饲养、自由饮水、正常免疫，营养饲料、饲养环境和饲养管理相同。连续记录产蛋120 d后，选择同一家系健康产蛋鸡。根据产蛋水平设置高水平组（BGB组，样本编号Y21、Y22和Y23；产蛋率89.00%左右）3只、中水平组（BZB组，样本编号Y24、Y25和Y26；产蛋率75.00%左右）3只和低水平组（BDB组，样本编号Y27、Y28和Y29；产蛋率44.67%左右）3只。经统计学分析，BGB组显著高于BZB组（P＜0.05）、极显著高于BDB组（P＜0.01）；BZB组极显著高于BDB组（P＜0.01）。采集300日龄新鲜粪便放入冻存管，分别编号后于-196 ℃液氮中保存备用。1.2主要试剂及仪器主要试剂：Soil DNA Kit 试剂盒（D5625-01，Omega Bio-Tek公司）、DNA定量试剂盒NanoDrop（NanoDrop ND-1000）、Q5® High-Fidelity DNA Polymerase（M0491L，NEB）、AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AP-GX-250，Axygen）、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（P7589，Invitrogen）。主要仪器：紫外分光光度计（RS232G，Eppendorf）、2100 生物分析仪（2100Bioanalyzer，Agilent）、PCR 扩增仪（2720，ABI）、电泳仪（DYY-6C，北京六仪）、TBS380荧光计（E6090，PROMEGA）、Microplate reader（FLx800，BioTek）。1.3DNA提取采用OMEGA Soil DNA Kit（D5625-01）试剂盒提取粪便微生物总基因组DNA，DNA样品储存在-20 °C；采用NanoDrop ND-1000对DNA样品进行定量，并通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。1.416S rDNA V3~V4区的PCR扩增及Illumina平台测序以提取的细菌总DNA为模板，根据16S rDNA的V3~V4高变区设计通用引物，各样品单独扩增。通用引物序列为：F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。PCR扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，F primer（10 μM）1 μL，R primer（10 μM）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。PCR扩增程序：98 ℃ 预变性2 min，98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25~30个循环；最后72 ℃延伸5 min。将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，用Axygen公司DNA Gel Extraction Kit回收纯化，回收产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Microplate reader上进行荧光定量。根据荧光定量结果，对各样本按比例混合后，使用Illumina平台进行双端（Paired-end）上机测序，由上海派森诺生物科技股份有限公司协助完成。1.5数据统计与分析对数据进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体等步骤。采用QIIME2（2019.4）等软件进行分类学组成分析、多样性分析、物种分类学注释、物种差异与标志物种等分析；采用PICRUSt2（phylogenetic Investigation of communities by reconstruction of unobserved states）软件及R语言对在线数据库进行功能潜能预测。数据结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1大骨鸡不同产蛋水平粪便微生物物种组成分析大骨鸡粪便微生物16S rDNA基因V3~V4区序列高通量测序后3个处理组间物种组成数量差异见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T001表1大骨鸡产蛋水平与微生物分类单元的关系项目BGB组BZB组BDB组域1.3±0.61.0±0.01.3±0.6门10.0±3.58.0±1.013.0±2.6纲17.7±7.113.3±2.521.3±5.5目27.0±7.5ab19.0±3.0b31.3±3.8a科41.7±11.2ab33.3±6.0b51.7±6.8a属53.0±19.3ab36.7±8.6b65.7±12.1a注：同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P0.01），小写字母不同表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05)；下表同。由表1可知，界、门、纲分类单元数量上差异不显著；BDB组目、科、属分类单元数量最多，与BZB组差异显著（P0.05）；BGB组介于BZB和BDB之间。产蛋性能与微生物分类门之间的关系见表2。由表2可知，所有组门水平丰度最高的都是厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），组间无显著差异（P0.05）；BGB的厚壁菌门和拟杆菌门合计占菌群96.8%，BZB占97.6%，BDB占93.1%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T002表2产蛋性能与微生物分类门之间的关系门名称BGB组BZB组BDB组Firmicutes0.912±0.0850.973±0.0320.713±0.219Bacteroidetes0.056±0.0880.003±0.0040.219±0.190Proteobacteria0.021±0.0270.002±0.0010.017±0.004Actinobacteria0.007±0.006ab0.005±0.004b0.015±0.004aFusobacteria0.001±0.0020.015±0.0250.001±0.002Synergistetes0.000±0.0000.000±0.0000.005±0.006WPS20.001±0.0010.000±0.0000.010±0.018Spirochaetes0.000±0.0000.000±0.0000.005±0.008TM70.000±0.0000.000±0.0000.003±0.005Tenericutes0.000±0.0000.000±0.0000.002±0.001Others0.001±0.001ab0.001±0.000b0.010±0.008a大骨鸡产蛋水平与丰度前20差异显著的微生物分类单元见表3。由表3可知，不同组间差异显著、高产蛋水平组（BGB）相对丰度高的是芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）的乳酸杆菌属（Lactobacillus），其乳酸杆菌属丰度是BZB组近2倍、BDB组近7倍；不同组间差异显著、高产蛋水平组（BGB）相对丰度低的梭菌纲（Clostridia）和红蝽菌纲（Coriobacteriia）、梭菌目（Clostridiales）和红蝽菌目（Coriobacteriales）、其他科、其他属。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T003表3大骨鸡产蛋水平与丰度前20差异显著的微生物分类单元分类等级名称BGB组BZB组BDB组门放线菌门0.007±0.006ab0.005±0.004b0.015±0.004a其他门0.001±0.001ab0.001±0.000b0.010±0.008a纲芽孢杆菌纲0.750±0.152Aa0.443±0.127ABb0.110±0.073Bc梭菌纲0.161±0.069Bb0.528±0.161ABa0.599±0.163Aa红蝽菌纲0.001±0.001b0.000±0.000b0.009±0.007a目乳杆菌目0.748±0.152Aa0.437±0.126ABb0.109±0.072Bc梭菌目0.161±0.069Bb0.528±0.161ABab0.599±0.163Aa红蝽菌目0.001±0.001b0.000±0.000b0.009±0.007a科乳杆菌科0.745±0.151Aa0.430±0.119ABb0.107±0.072Bc其他科0.061±0.045Bb0.061±0.022Bb0.316±0.089Aa属乳酸杆菌属0.745±0.151Aa0.430±0.119ABb0.107±0.072Bc其他属0.191±0.074Bb0.518±0.096Aa0.638±0.104Aa2.2大骨鸡不同产蛋水平粪便微生物alpha和beta多样性（见图1、图2）由图1可知，BDB组丰富度Chao1和Observed species指数、多样性Shannon和Simpson指数、进化多样性Faith's PD指数、均匀度Pielou's evenness指数均最高；BGB组覆盖度Good's coverage指数最高。由图2可知，PCoA分析结果3组之间明显不同，彼此没有交叉，BGB组内部样品间一致性最好。NMDS分析表明，BGB组与BZB组和BDB组距离远，且BGB组内部3个样本之间多样性差异小、均匀一致；BZB组3个样本虽然纵坐标距离相近，但横坐标距离大；BDB组3个样本内部多样性差异大、空间距离较大。因此，BGB组的微生物群落与BZB组和BDB组有明显差别。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.F001图1不同产蛋水平的alpha多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.F002图2不同产蛋水平的beta多样性分析(a)PCoA分析结果 （b）NMDS分析结果不同产蛋水平粪便微生物属水平的层次聚类结果见图3。由图3可知，BGB组3个样本微生物组成比较接近，乳酸杆菌属（Lactobacillus）占绝对优势，为高产鸡消化道微生物特征；BZB组3个样品和BDB组的1个样品（Y29）微生物组成比较接近，乳酸杆菌属占主体，但比例低于高产BGB组，为中等产蛋水平特点；BDB组剩余2个样品（Y27和Y28）的微生物组成复杂，拟杆菌属（Bacteroides）和粪杆菌属（Faecalibacterium）所占比例大，为低产鸡特点。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.F003图3不同产蛋水平粪便微生物属水平的层次聚类结果2.3大骨鸡不同产蛋水平粪便微生物物种差异与标志物分析3个处理组ASV/OTU丰度情况的韦恩图见图4。由图4可知，3组共有226个相同的种类，BGB组、BZB组和BDB组自身特有的种类（比例）分别是1 186个（74.08%）、1099个（68.18%）和5260个（87.61%）。由此可见，BDB组微生物种类最丰富，与BGB和BZB组相同的种类占比小，与图3结果相同；而BGB和BZB组种类数量相似，相同的微生物种类占比较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.F004图4各组ASV/OTU丰度差异韦恩图采用MetagenomeSeq分析不同组间属的差异见表3。由表3可知，不同产蛋水平组差异主要在厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。基于LEfSe分析BGB和BDB组间粪便微生物菌属的差异见表4。由表4可知，BGB处理组的特异菌属是丰度高的厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科的乳酸杆菌属。而BDB处理组的特异纲或属较复杂，包括厚壁菌门、梭菌纲、梭菌目、组织菌科的ph2菌属；放线菌门、放线菌纲、双歧杆菌目、双歧杆菌科的双歧杆菌属和TM7门的TM7_3纲；这三类纲或属的丰度较近，但总和的比例较大，说明BDB组的粪便微生物组成复杂、各纲或属间势均力敌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T004表4基于LEfSe分析大骨鸡BGB和BDB组间粪便微生物差异显著的菌属差异组别门纲目科属丰度LDA值P值BGB组厚壁菌门芽孢杆菌纲5.875 15.490 50.027 3厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌目5.873 85.488 40.027 3厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌目乳杆菌科5.872 35.472 60.027 3厚壁菌门芽孢杆菌纲乳杆菌目乳杆菌科乳酸杆菌属5.872 15.508 50.027 3BDB组厚壁菌门梭菌纲梭菌目组织菌科ph2菌属2.198 65.401 90.022 1放线菌门放线菌纲双歧杆菌目双歧杆菌科双歧杆菌属2.990 34.648 20.045 9TM7门3.506 94.486 50.034 7TM7门TM7_3纲3.506 94.500 90.034 72.4代谢通路分析（见图5、表5）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T005表3基于MetagenomeSeq分析不同产蛋水平组间微生物显著差异的菌属组别BZBBDB门属门属BGB组厚壁菌门乳酸杆菌属、梭菌属、粪杆菌属、巨单胞菌属、颤螺旋菌属、瘤胃球菌属、SMB53菌属厚壁菌门乳酸杆菌属、梭菌属、肠球菌属拟杆菌门拟杆菌属、副杆菌属、普氏菌属变形菌门嗜冷杆菌属、志贺氏菌属BZB组厚壁菌门梭菌属、乳酸杆菌属、土杆菌属由图5可知，大骨鸡肠道菌群共涉及7个第一层次代谢通路，排在前三位的是生物合成（丰度占65.04%）、退化/利用/同化（丰度占16.80%）、前体代谢产物和能量的产生（丰度占13.90%），丰度总计95.74%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.F005图5大骨鸡所有样本粪便微生物代谢通路丰度由表5可知，BGB组与BZB和BDB差异显著的共15个代谢通路。其中，5个代谢通路中BGB上调，其余10个BGB均下调。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.018.T006表5大骨鸡不同产蛋性能粪便微生物差异显著的代谢通路代谢通路名称通路描述组别平均值标准差ANAGLYCOLYSIS-PWY糖酵解III（来自葡萄糖）BGB组2 080.35Aa43.88BZB组1 831.08Bb88.06BDB组1 766.66Bb93.41COLANSYN-PWY辅酶A生物合成ⅠBGB组1 923.81Aa75.87BZB组1 653.19Bb95.27BDB组1 543.13Bb73.52P461-PWY己糖醇发酵生产乳酸、甲酸、乙醇和醋酸酯BGB组1 392.53Aa112.39BZB组814.65Bb167.25BDB组290.75Cc97.47PWY-5686UMP生物合成BGB组2 192.25Aa77.82BZB组1 873.82Bb117.34BDB组1 774.55Bb106.97PWY-7221鸟嘌呤核苷从头生物合成BGB组2 179.36Aa120.42BZB组1 804.14Bb137.83BDB组1 617.14Bb66.56DAPLYSINESYN-PWYL-赖氨酸生物合成ⅠBGB组883.18Bb74.04BZB组1 387.66Aa108.13BDB组1 277.63Aa167.70NONOXIPENT-PWY戊糖磷酸途径（非氧化分支）BGB组1 418.55b384.90BZB组2 263.35a230.17BDB组2 271.24a183.44PWY-6269从辅酶Ⅱ中补救腺苷钴胺BGB组410.02b245.73BZB组877.05a173.01BDB组1 215.63a77.43PWY-6892噻唑生物合成I（大肠杆菌）BGB组573.42b226.84BZB组1 208.72a196.06BDB组1 173.29a288.31PWY-6897硫胺素的补救ⅡBGB组604.66b106.72BZB组1 090.16a166.20BDB组1 001.11a237.70PWY-7199嘧啶脱氧核苷的补救BGB组649.26b290.55BZB组1 069.43a86.16BDB组1 166.71a43.17PWY-7242D-果糖醛酸降解BGB组374.63b181.80BZB组817.31a185.52BDB组885.07a126.94PWY-75396-羟甲基二氢蝶呤二磷酸生物合成III（衣原体）BGB组519.76b224.57BZB组950.98a178.12BDB组1 068.43a122.96RIBOSYN2-PWY黄素生物合成Ⅰ（细菌和植物）BGB组769.15b262.20BZB组1 187.65a118.45BDB组1 219.83a75.37THISYN-PWY硫胺素二磷酸生物合成Ⅰ的超级通道BGB组404.30Bb121.99BZB组973.19Aa159.47BDB组1 002.39Aa187.03注：同列同项目数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P0.01）；小写字母不同表示差异显著（P0.05）。3讨论3.1不同产蛋水平粪便微生物门水平的组成和多样性鸡肠道微生物菌群在营养资源利用和分解代谢方面进行竞争和协同合作[10]。本试验发现，产蛋高峰期大骨鸡粪便微生物丰度最高的是厚壁菌门和拟杆菌门，占菌群93.1%及以上，与以往多数研究结果一致[7,11-13]，而宁都黄鸡和肉种鸡丰度最高前两位略有差异，是拟杆菌门和厚壁菌门[6,8]。Cardenas等[14]采用Meta分析研究9篇公开发表的文献，包括鸡盲肠微生物组试验的324个样本，8 843 573条单末端可用序列，显示鸡盲肠微生物共有11个门，最常见的是厚壁菌门，其次是拟杆菌门和变形菌门。与本试验结果一致。鸡饲粮中的纤维素和非淀粉多糖不能在小肠中被消化，而在盲肠定植的厚壁菌门和拟杆菌门可以对其进行消化并产生短链脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）[15-16]；SCFA可以增加增殖细胞数量，扩展肠道吸收表面[17]。厚壁菌门负责氮循环，提高获取食物能量的效率[18-19]。高丰度的厚壁菌门与有益的免疫调节有关[3,20]，拟杆菌门菌群的发酵终产物有宿主和肠道微生物所需的丙酸盐和乙酸盐[21-23]。3.2不同产蛋水平粪便微生物属水平的组成和多样性Cardenas等[14]发现各种类型鸡盲肠中微生物共有109个菌属，所有样品中5个菌属最常见，即颤螺旋菌属（Oscillospira）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、梭菌属（Clostridium）和瘤胃球菌属（Ruminococcus），这些属大多与宿主的生长和健康有关[14]。本试验中，大骨鸡高产水平组与中产组和低产组差异显著、且相对丰度占绝对优势的是乳酸杆菌属（Lactobacillus），与文献报道的褐壳蛋鸡和肉种鸡的高产蛋率组结果一致[7-8]，所以推测乳酸杆菌属是高产鸡消化道微生物特征。而大骨鸡低产组的拟杆菌属（Bacteroides）和粪杆菌属（Faecalibacterium）所占比例大。粪杆菌属可以表达乙酰辅酶A乙酰转移酶和参与丁酸生产的几种酶[24]，而丁酸具有抗炎和促生长作用。乳酸杆菌进入肉仔鸡肠道后可以分泌多种酶类，也可以上调肉仔鸡肠道转运载体的表达，促进日粮中营养物质和微量元素消化、吸收，提高营养物质利用率。乳酸杆菌的代谢产物通过降低肠道pH值，抑制致病菌的生长[25]，抑制空肠弯曲菌在肉鸡中的定植[26]，所以具有提高免疫功能的作用。Jin等[27]发现，日粮中单独添加嗜酸乳杆菌或12种乳酸杆菌的混合物均可提高肉仔鸡小肠中淀粉酶的活性。Jahromi等[28]发现，在日粮中添加嗜酸乳杆菌和戊糖乳杆菌可以增加肌肉脂肪酸含量。李追[29]发现，日粮中添加嗜酸乳杆菌提高了肠道中乳酸杆菌属等有益菌的丰度，提高肉仔鸡生长性能。3.3不同产蛋水平粪便微生物的代谢通路分析杨凌宇[30]比较分析高体重家系（high weight line，HW line）和低体重家系（low weight line，LW line）盲肠微生物发现，HW家系中8个产短链脂肪酸的属的丰度显著增加；HW家系显著富集了与宿主生长相关的通路，如三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循环、糖异生作用、氧化磷酸化及过氧化物酶体增殖剂激活受体（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信号通路。本试验对所有样本的代谢通路分析发现，粪便菌群主要参与生物合成、退化/利用/同化、前体代谢产物和能量的产生3个一级途径，其中参与生物合成的丰度（65.04%）远远高于退化/利用/同化的丰度（16.80%），还有13.90%丰度进行发酵、糖酵解、戊糖磷酸途径、光合作用、TCA循环、呼吸等前提代谢物和能量的产生，即大骨鸡肠道微生物的主要功能是进行生物合成和获取能量。对大骨鸡不同产蛋水平微生物参与的代谢通路进行差异分析，发现高产蛋率组（BGB）与中、低组（BZB和BDB）差异显著的代谢通路15个（表5），其中5个代谢通路（糖酵解Ⅲ；辅酶A生物合成Ⅰ；己糖醇发酵生产乳酸、甲酸、乙醇和醋酸酯；尿嘧啶一磷酸核苷酸（UMP）生物合成；鸟嘌呤核苷从头生物合成）中BGB极显著（P0.01）上调，其余10个BGB均显著（P0.05）下调。糖酵解属于一级代谢通路的第4类（前体代谢物和能量的产生）。糖酵解可以氧化葡萄糖生成ATP、还原剂和丙酮酸，在此过程中产生生物体13种前体代谢物中的6种（β-D-葡萄糖6-磷酸、β-D-呋喃果糖6-磷酸、甘油磷酸、3-磷酸-D-甘油酯、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸）。糖酵解又作为一种兼用代谢途径，既涉及分解代谢，又可以进行合成代谢。除了两种酶促反应外，所有酶促反应都是可逆的。由于各种降解途径在许多不同的点进入糖酵解，根据所利用的碳源及细胞对前体代谢物和能量的需要，糖酵解或糖酵解的一部分可以向前或向后运行[31]。所以，糖酵解在所有生长条件下都是必不可少的。本试验大骨鸡BGB组极显著（P0.01）上调的4个代谢通路（辅酶A生物合成Ⅰ；己糖醇发酵生产乳酸、甲酸、乙醇和醋酸酯；UMP生物合成；鸟嘌呤核苷从头生物合成）均属于一级代谢通路的第1类（生物合成），又进一步分类属于丰度最高的2个二级代谢通路。通过UMP和鸟嘌呤核苷合成代谢通路，可以进一步转化为其他类型的核苷酸，为细胞DNA复制和自身的增殖提供原料。通过辅酶A生物合成途径可以合成生物体必需、但动物不能合成的维生素B5[32]；通过乳酸、甲酸、乙醇及醋酸酯合成途径，使糖酵解最终产物丙酮酸代谢形成（S）-乳酸、甲酸、乙醇和醋酸盐[33]。4结论大骨鸡不同产蛋水平粪便微生物丰度结构存在显著差异。高产蛋性能大骨鸡微生物特征是高丰度乳酸杆菌属，低产蛋性能大骨鸡微生物组成复杂。高产蛋性能大骨鸡消化道微生物菌群功能主要是生物合成和糖酵解。