反刍动物瘤胃发酵生成的甲烷会造成饲料能量损失，加剧温室效应。因此，减少反刍动物瘤胃内甲烷的生成量是目前研究的热点。近年来，已经筛选确定了某些硝基酯类化合物对抑制瘤胃甲烷生成通路的特异性。3-NOP是一种硝基链烷酸的衍生物，可作为反刍动物的饲料添加剂，调控反刍动物瘤胃甲烷生成量。3-NOP的化学结构与瘤胃甲烷生成过程中甲基辅酶M还原酶（MCR）类似，能够替代MCR结合辅酶B，从而减少MCR转换生成甲烷的过程，对瘤胃中用于甲烷合成的辅酶具有特异性的抑制作用[1]。在肉牛[2-5]、奶牛[6-9]、绵羊[10]的饲粮中添加3-NOP的体外试验表明，3-NOP处理均可不同程度地降低瘤胃甲烷的生成量，且不影响反刍动物的生产性能，表明3-NOP是一种有效的甲烷抑制剂。但目前我国尚有3-NOP在反刍动物中的应用报道较少，仅Liu等[11]开展了奶牛方面的体外研究，郝增华等[12]和张振威等[13]报道了3-NOP在反刍动物中的使用方法及应用前景。因此，本试验以mcrA功能基因为研究对象，使用饲喂高精料日粮的肉用西门塔尔牛作为瘤胃液供体动物，采用体外模拟瘤胃发酵的方法，研究不同添加剂量的3-NOP对瘤胃甲烷生成及甲烷菌区系多样性的影响，为3-NOP在反刍动物生产的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料3-NOP由韩国国立忠北大学反刍动物营养与生理学实验室提供，黄色透明液体，纯度≥98%。1.2试验动物及基础日粮选用4头健康、体重510 kg安装永久瘤胃瘘管肉用西门塔尔牛作为瘤胃液供体动物。每天8：00、18：00饲喂2次，自由饮水。基础日粮参照《肉牛饲养标准》[14]配制，精粗比为70∶30，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米41.26粗蛋白质/%12.13麦麸6.10中性洗涤纤维/%34.85豆粕3.20酸性洗涤纤维/%22.04玉米胚芽粕6.60钙/%0.43玉米DDGS10.00磷/%0.35磷酸氢钙0.08综合净能/(MJ/kg)6.35碳酸钙0.26小苏打0.70食盐0.80预混料1.00玉米秸秆30.00注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 3 600 IU、VD3 1 200 IU、VE 200 IU、Cu 15 mg、Fe 65 mg、Mn 25 mg、Zn 30 mg、Se 0.1 mg、Co 1 mg。2.营养水平中综合净能为计算值，其余均为实测值。1.3试验设计采用单因素完全随机设计，共设4组，对照组（C组）、低剂量组（LD组）、中剂量组（MD组）、高剂量组（HD组）分别以干物质为基础在每克发酵底物中添加0、0.4、0.8、1.2 mg的3-NOP。各组发酵底物与瘤胃液供体动物饲喂日粮一致，65 ℃烘干，粉碎，过40目筛。连续24 h体外培养，试验重复4次，每组设3个平行试验。1.4体外发酵试验试验当天晨饲2 h后，使用瘤胃瘘管采集4头供体牛的瘤胃液，转入提前预热、充满CO2的保温瓶，带回实验室。参考Menke等[15]体外发酵方法配制人工缓冲液，将瘤胃液经四层纱布过滤后与人工唾液按1∶2比例混匀，倒入提前置于39 ℃恒温水浴锅中的分液瓶里，连续不断向瓶内通入CO2，确保厌氧状态。另称取1 g发酵底物及对应处理剂量的3-NOP于100 mL螺口发酵瓶中并充满CO2，加入80 mL混合培养液，发酵瓶配套GL45型号单孔补料瓶盖旋紧密封，补料瓶盖通过硅胶软管外接200 mL铝箔气体采集袋，收集发酵产生的气体，将发酵瓶转入空气浴振荡培养箱，恒温39 ℃、振荡频率140 r/min发酵培养24 h，取出发酵瓶，冰水浴中终止发酵。使用注射器抽出气体采集袋中全部气体，根据刻度读数统计24 h发酵总产气量，采集10 mL气体至另一气体采集袋中用于后续气体成分分析。采集发酵液于50 mL无菌离心管里放入液氮中保存，用于后续高通量测序。1.5测定指标及方法1.5.1体外发酵参数利用高效气相色谱仪（TP-2060）测定发酵气体中氢气与甲烷产量，气体六通阀进样，配置热导检测器（TCD），色谱柱选用TDX-01（φ 3 mm × 3 m）为分析柱，OV-101（φ 3 mm × 1 m）为参考柱。氩气为载气，流量设定30 mL/min，进样量1 mL，柱温50 ℃，检测器100 ℃，桥流160 mA。甲烷占24.83%、氢气占1.94%各组分气体产量=24 h总产气量×百分占比(1)供体动物基础日粮及发酵底物中粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）、钙（Ca）、磷（P）参考张丽英[16]方法测定。体外干物质降解率参照Liu等[17]的尼龙袋法进行计算。1.5.2瘤胃体外发酵甲烷菌区系测定以甲烷菌特异性mcrA基因为目标进行扩增和测序，采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit DNA试剂盒（美国Omega公司）进行样品中总DNA提取，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，应用NanoDrop2000（美国Thermo Scientific公司）紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。以提取检测合格的DNA为模板进行16S rRNA基因序列扩增，扩增上游引物序列P1（5'-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-3'）和下游引物P2（5'-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-3'）。PCR扩增程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共25个循环；72 ℃稳定5 min，4 ℃保存（PCR仪：ABI GeneAmp® 9700）。采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物。将符合要求的PCR产物使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）进行纯化回收，采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行文库构建，使用Illumina公司的NovaSeq PE250平台进行测序（上海派森诺生物科技有限公司）。1.6数据统计与分析高通量测序数据分析均在派森诺基因云平台（https://www.genescloud.cn/home）上进行，采用Mothur软件（http://www.mothur.org/wiki/Calculators）计算Alpha多样性指数（Chao1指数、Simpson指数）等，采用Wilxocon秩和检验进行Alpha多样性的组间差异分析；使用基于Bray-curtis距离算法的PCoA分析（主坐标分析）检验样本间微生物群落结构的相似性，结合PERMANOVA非参数检验分析样本组间微生物群落结构差异显著性；用LEfSe分析（http://huttenhower.sph.harvard.edu/LEfSe）（LDA2，P0.05）组间从门到种水平丰度显著差异的甲烷菌类群。瘤胃体外发酵参数数据经Excel 2021初步整理，采用SAS 9.4进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同添加剂量3-NOP对体外发酵气体产量和干物质降解率的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，各3-NOP处理组发酵底物的甲烷产量和每克可降解底物的甲烷产量均显著降低（P0.05）。随着3-NOP添加剂量的增加，发酵底物的甲烷产量和每克可降解底物甲烷产量均呈线性降低趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.T002表2不同添加剂量3-NOP对体外发酵产气量及干物质降解率的影响项目干物质降解率/%总产气量/mL甲烷产量/mL氢气产量/mL每克可降解底物总产气量/(mL/g)每克可降解底物甲烷产量/(mL/g)每克可降解底物氢气产量/(mL/g)C组（对照组）46.598a145.00025.970a0.370d311.192b55.802a0.794dLD组45.957a144.66721.510b2.585c314.963b46.861b5.609cMD组45.156a143.3338.660c9.421b318.093b19.381c20.825bHD组40.294b143.0004.887d15.237a355.123a12.209c37.773aSEM0.9831.5990.9730.5437.2722.6730.894P值0.0070.7720.0010.0010.0090.0010.001注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。与对照组相比，各3-NOP处理组发酵底物的氢气产量和每克可降解底物的氢气产量显著增加（P0.05）。随着3-NOP添加剂量的增加。氢气产量和每克可降解底物氢气产量均呈线性增加趋势，其中LD组、MD组。HD组氢气产量分别是对照组的6.98、25.46、41.18倍，每克可降解底物氢气产量分别是对照组的7.06、26.23、47.57倍。HD组发酵底物的干物质降解率显著低于其他组（P0.05），但每克可降解底物总产气量显著高于其他组（P0.05）。2.2不同添加剂量3-NOP对体外发酵瘤胃甲烷菌区系的影响2.2.1不同添加剂量3-NOP对体外瘤胃发酵甲烷菌α多样性的影响（见图1）试验各组所有样本的测序覆盖度均达到了0.99以上，表明基本均已检测出各组样本中的物种，充分满足了后续其他指标的分析要求。本试验采用DADA2和Vsearch方法对初步检测到的序列进一步质量过滤、去重及聚类等步骤分析处理，发现每个处理组均获得有效序列读数54 549条以上，OTU分类单元280个以上，各组间差异不显著（P0.05）。由图1可知，与对照组相比，各3-NOP处理组瘤胃发酵Chao1指数有增加的趋势（P0.05）；与对照组和LD组相比，MD组瘤胃发酵Simspon指数显著降低（P0.05）。图1不同添加剂量3-NOP对体外瘤胃发酵甲烷菌α多样性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F1a1（a）Goods_coverage指数 （b） Observed_species指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F1a2（c）Chao1指数 （d） Simspon指数2.2.2不同添加剂量3-NOP对体外瘤胃发酵甲烷菌β多样性的影响（见图2）图2是基于样本中物种OTU的丰度信息，特征序列间的进化关系等采用加权算法计算Bray-Curtis距离，并进行PCoA分析，以此反映甲烷菌区系的β多样性变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F002图2不同添加剂量3-NOP对体外瘤胃发酵甲烷菌β多样性的影响由图2可知，主坐标PCo1和PCo2在不同样本间的甲烷菌区系结构存在48.1%和23.2%的差异性，各组内4个平行样本均可以聚合在一起，其中MD组和HD组在坐标轴上分别位于不同的分区且投影距离较远，表明这两组与其他处理组间的甲烷菌区系均不具有相似性，但对照组和LD组间瘤胃的甲烷菌区系相似性较高，表明甲烷菌的结构组成会随着不同添加剂量的3-NOP发生显著变化。2.2.3不同添加剂量3-NOP对体外发酵瘤胃甲烷菌相对丰度的影响（见表3）由表3可知，本研究在门水平上只鉴定出一个分类物种，各处理组瘤胃甲烷菌区系主要以广古菌门（Euryarchaeota）为主，且无显著差异（P0.05）。在属水平上，4个组中瘤胃的优势甲烷菌均由甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）和甲烷球形菌属（Methanosphaera）组成，二者相对丰度占总甲烷菌的90%以上。与对照组相比，3个3-NOP处理组瘤胃甲烷球形菌属（Methanosphaera）的相对丰度显著降低（P0.05）；MD组瘤胃Candidatus Methanomethylophilus和未分类甲烷菌属的相对丰度显著提高（P0.05）。在种水平上共鉴定出11个甲烷菌种，反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）、史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）和Methanobrevibacter sp. D5是4个处理组瘤胃中共有的优势甲烷菌种，相对丰度占总甲烷菌的14%左右，未鉴定菌种相对丰度在75%左右。与对照组相比，HD组瘤胃反刍甲烷短杆菌种（Methanobrevibacter ruminantium）的相对丰度显著升高（P0.05），但未鉴定菌种的相对丰度显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.T003表3不同添加剂量3-NOP对体外发酵瘤胃甲烷菌区系组成的影响项目C组（对照组）LD组MD组HD组SEMP值门水平广古菌门100.000100.000100.00099.9800.0100.426属水平甲烷短杆菌属87.34187.80084.28888.0721.4930.298甲烷球形菌属9.166a6.419b5.689b6.809b0.6150.010Candidatus Methanoplasma1.8132.7573.0893.6220.8180.487Candidatus Methanomethylophilus1.409b2.714b5.978a0.871b0.7750.002甲烷八叠球菌属0.1550.1340.0270.2650.1400.700甲烷绳菌属0.0010.0020.0030.0030.0020.874未分类甲烷菌属0.115b0.174b0.926a0.358b0.1390.008种水平反刍兽甲烷短杆菌9.817b11.454b6.503b19.692a1.6400.001史氏甲烷短杆菌6.5397.0805.7554.1490.7570.082Methanobrevibacter sp. D51.421bc2.156ab2.810a0.829c0.3240.005米氏甲烷短杆菌0.1390.1230.2180.2700.0400.074奥蕾氏甲烷短杆菌0.0750.2020.0850.1460.0440.198未分类菌种82.009ab78.985ab84.629a74.914b1.9900.025%2.2.4不同添加剂量3-NOP对体外发酵瘤胃甲烷菌标志物种差异分析将不同处理组的样本在属（种）水平的群落组成根据分类单元的丰度或样本间的相似程度进行聚类分析，从而对相对丰度大小接近的分类单元和样本进行排序，以不同颜色表示处理组间甲烷菌群落组成的差异变化，结果见图3。图3不同添加剂量3-NOP对甲烷菌物种聚类组成影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F3a1（a）属水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F3a2（b）种水平由图3（a）可知，在属水平上，对照组瘤胃中的甲烷球形菌属（Methanosphaera）、Methanomassiliicoccus和甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）是主要的优势菌种；LD组中的甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）具有较高的丰度；MD组中的优势菌种主要以甲烷杆菌属（Methanobacterium）、Candidatus Methanoplasma、甲烷丝状菌属（Methanothrix）、甲烷绳菌属（Methanolinea）、Methanoregula、Candidatus methanomethylophilus、甲烷微菌属（Methanomicrobium）和甲烷袋状菌属（Methanoculleus）为主；而HD组中的优势菌种主要以甲烷杆菌属（Methanobacterium）、Candidatus Methanoplasma、甲烷丝状菌属（Methanothrix）、甲烷绳菌属（Methanolinea）和甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）为主。由图3（b）可知，在种水平上对照组瘤胃中的史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）、巴氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）和Methanosarcina subterranea是主要的优势菌种；LD组瘤胃中的Methanobrevibacter olleyae、Methanobrevibacter sp. D5、Methanobrevibacter sp. WBY1和史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）的相对丰度较高；MD组瘤胃中的优势菌种主要以运动甲烷微菌（Methanomicrobium mobile）、Methanobrevibacter sp. D5和Methanobrevibacter sp. WBY1为主；而HD组中的优势菌种主要以米氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter millerae）、反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）、马氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina mazei）和Methanobacterium congolense为主。为了鉴别不同分组间主要甲烷菌标志性物种的差异，研究进行了LEfSe分析，结果见图4。图4不同添加剂量3-NOP对甲烷菌LEfSe影响分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F4a1（a）LDA值分布柱状图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.16.001.F4a2（b）物种分类学分支图显著差异物种LDA值分布柱状图可以展示每个组内显著富集的物种及其重要性程度；物种分类学分支图可以展示在各组样品中标志物种的分类学层次分布。图4（a）中纵坐标表示LDA值分值越高表示对应的标志性物质对组间差异影响越大。图4（b）中由内至外辐射的圆圈代表了由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每一个小圆圈代表该水平下的一个分类，小圆圈直径大小与相对丰度大小成正比。无色空心节点表示组间无显著差异的物种，相反有色实心节点表示对应组间有显著差异，不同颜色代表不同的分组。由图4可知，对照组瘤胃中甲烷球形菌属（Methanosphaera）；MD组瘤胃中甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）、甲烷微菌属（Methanomicrobium）、Methanobrevibacte sp. D5以及运动甲烷微菌（Methanomicrobium mobile）；HD组瘤胃中反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）、马氏甲烷八叠球菌（Methanosarcina mazei）等标志性物种分别被显著富集；而在LD组中没有发现其标志性差异物种。由图4（a）可知，各组中富集丰度最高物种的LDA分值均大于其他分类单元，表明其对组间差异的影响更大。3讨论3.1不同添加剂量3-NOP对体外发酵气体产量及发酵底物干物质降解率的影响研究表明，3-NOP抑制瘤胃甲烷生成效果与动物种类[18]、饲粮类型[19-20]以及饲喂剂量[21-22]密切相关。Melgar等[21]、Romero-Perez等[22]和Hristov等[23]研究均发现，在生长育肥期肉牛或泌乳奶牛的饲粮中添加不同水平的3-NOP均可不同程度地降低瘤胃甲烷的生成量，尤其是高剂量水平处理时，其抑制效果达38%，表明3-NOP抑制瘤胃甲烷生成的效率与添加水平成正比。本研究发现，3种添加剂量的3-NOP均可显著降低了体外发酵24 h甲烷的产量和每单位可降解底物的甲烷产量，且随着添加剂量的增多甲烷的生成量呈线性降低趋势，与Dijkstra等[18]和Alemu等[24]的研究结果基本一致，表明3-NOP对甲烷菌的MCR具有高效的特异性抑制作用，且呈现出显著的线性剂量效应。本试验研究显示，LD组和MD组发酵底物氢气产量和每单位可降解底物的氢气产量显著增加，但对总气体产量和干物质降解率却无显著影响，与Alemu等[24]和Liu等[11]的研究结果一致。本试验中，HD组发酵底物的干物质降解率明显降低，表明过大剂量的3-NOP处理对瘤胃发酵产生了负面效应。因此，调控瘤胃甲烷生成的同时应该考虑瘤胃生物代谢氢的平衡，通过结合多种氢调控机制联用的途径，或许能够降低生产应用中的风险，生产中更加具有实际应用价值。3.2不同添加剂量3-NOP对体外发酵瘤胃甲烷菌区系的影响在瘤胃甲烷生成过程中，甲基辅酶M还原酶（MCR）是瘤胃甲烷菌合成甲烷过程中所必需的酶，具有高度的专一性，目前仅在所有已知产甲烷的古细菌中发现存在该物质[25]。mcrA作为一个特异性的功能基因常被用于定性鉴定能生成甲烷的古细菌。因此，通常认为反刍动物瘤胃甲烷生成与产甲烷菌区系的变化密切相关。目前，关于3-NOP对反刍动物瘤胃甲烷菌区系影响的研究结果并不一致。如Romero-Perez等[22]研究表明，给安格斯小母牛饲喂3-NOP可以显著降低瘤胃甲烷排放，但对瘤胃内甲烷菌、细菌及瘤胃原虫数量无显著影响。Liu等[26]通过体外研究发现，饲粮添加3-NOP可以显著减少瘤胃甲烷生成，但对瘤胃甲烷菌群的α和β多样性没有显著影响，可显著增加Methanobrevibacter sp. AbM4的相对丰度。但Gruninger等[4]和Alemu等[5]研究发现，3-NOP可以显著降低甲烷菌的α和β多样性，而且甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）是古细菌中占主导地位的优势菌种。上述研究结果表明，3-NOP对瘤胃甲烷菌区系的影响可能与添加剂量和日粮种类有关。本试验研究发现，在高精日粮中添加3-NOP具有增加甲烷菌群落Chao1指数的趋势，但Simpson指数却明显降低。进一步从甲烷菌群组成相对丰度变化的结果分析，各组中甲烷菌在门水平上主要以广古菌门（Euryarchaeota）为主，在属水平上主要以甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）为主，与前人报道的研究结果基本一致[4-5]。但本试验中其他种类瘤胃甲烷菌相对丰度的变化，如甲烷球形菌属（Methanosphaera）、Candidatus methanomethylophilus以及种水平上的反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）、Methanobrevibacter sp. D5等方面与之前的研究报道都不尽相同。β多样性分析结果显示，中、高剂量3-NOP处理可以显著改变了甲烷菌群的结构组成，表明3-NOP在一定程度上虽丰富了甲烷菌群的种类，但也导致甲烷菌群发展不均衡。由本研究的物种聚类热图结合LEfSe分析结果可知，中、高剂量3-NOP处理组甲烷菌群中的优势菌种和标志性差异菌种的数量均显著高于对照组。本试验发现，3-NOP处理组可以增加瘤胃甲烷菌的相对丰度，但却显著降低了甲烷产量，推测可能是3-NOP处理组中优势甲烷菌的甲烷生成效率很低，或者3-NOP对古细菌中占主导地位产甲烷菌的MCR有更强的抑制作用。因此，反刍动物日粮中添加3-NOP均可不同程度地减少瘤胃甲烷排放，但不同3-NOP处理对瘤胃甲烷菌区系变化影响不一致，还有待进一步研究。4结论本试验表明，高精料日粮中添加不同水平的3-NOP可以显著降低瘤胃甲烷菌多样性，改变区系结构，对瘤胃甲烷的生成具有明显的抑制作用，且随着3-NOP添加剂量的增多，甲烷的生成量呈线性下降趋势。基于瘤胃发酵效率考虑，日粮中添加0.8 mg的3-NOP较为适宜。