1963年，Zeya等[1]在豚鼠多形核嗜中性粒细胞裂解物中发现了一种具有抗菌作用的碱性多肽物质，称为抗菌肽（AMPS）。后续研究陆续在动植物体内发现AMPS的存在。哺乳防御素是AMPS中的一大类，是一种阳离子型多肽，具有抵抗细菌、病毒和真菌的能力。哺乳动物防御素对某些恶性肿瘤细胞具有杀伤作用，能够在体内发挥免疫调节的作用，促进成纤维细胞的有丝分裂及炎症部位的组织修复。哺乳动物防御素在动物生产中也发挥着积极的作用。不同于传统抗生素，防御素作为机体免疫系统的一部分应用于动物生产，不易产生耐药性，在替抗生素药品研发方面具有较高的开发价值和良好的应用前景。本文对哺乳动物防御素生物学作用的研究进展进行综述，以期加强对哺乳动物防御素的作用机制的认识，为哺乳动物防御素应用于动物饲料添加剂、动物疾病防治等领域中提供参考。1哺乳动物防御素种类及分布1.1α-防御素α-防御素主要由嗜中性粒细胞和小肠潘氏细胞分泌[2]。α-防御素包括人的中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中的髓源性防御素HNP1-4[3]；豚鼠的中性粒细胞中的防御素GPDEF-1、GPDEF-2[4]；人的小肠潘氏细胞中的肠源性防御素HBD-5和HBD-6[5]；小鼠小肠潘氏细胞中19种α-防御素，被称为隐窝素（cryptdins）[6]；恒河猴的小肠潘氏细胞中的RED-1~RED-6[7]等。1.2β-防御素β-防御素主要由上皮细胞分泌[8]，大多分布在哺乳动物的胃肠道、口腔黏膜、呼吸道、肺和皮肤等器官的上皮细胞内[9]。β-防御素包括小鼠肺、气管、肾脏和雄性生殖管道的上皮细胞中的防御素mBD-1~mBD-6[10]；大鼠肺、气管、肾脏和雄性生殖管道的上皮细胞中的防御素rBD-1、rBD-2[11]；人上皮细胞中的防御素HBDs[12-13]；鸵鸟肺脏、气管、胸腺、肾脏、肝脏的上皮细胞中的防御素AvBD-2和AvBD-7[14]等。1.3θ-防御素θ-防御素发现较晚，仅在恒河猴、猕猴和狒狒的中性粒细胞和单核细胞中分离得到11种不同的θ-防御素，人和其他哺乳动物体内尚未发现θ-防御素的表达[15]。哺乳动物体内防御素分类见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.027.T001表1哺乳动物体内防御素分类防御素分类防御素分布氨基酸残疾数/个二硫键连接位置文献来源α-防御素嗜中性粒细胞和潘氏细胞29~35Cys Ⅰ-Cys ⅥCys Ⅱ-Cys ⅣCys Ⅲ-Cys ⅤLi等[16]β-防御素上皮细胞40Cys Ⅰ-Cys ⅤCys Ⅱ-Cys ⅣCys Ⅲ-Cys ⅥChairatana等[17]θ-防御素中性粒细胞和单核细胞12Cys Ⅰ-Cys ⅥCys Ⅱ-Cys ⅤCys Ⅲ-Cys ⅣTran等[18]2哺乳动物防御素的作用2.1抗菌与抗病毒哺乳动物防御素是先天免疫系统的组成成分，具有广泛的抗菌活性。人类表达的α-防御素和β-防御素，对有包膜和无包膜病毒均具有抗病毒活性[19]。防御素敏感病毒物种的多样性反映了多种抗病毒机制。防御素主要是通过与靶细胞细胞膜上的阳离子精氨酸侧链和细菌膜上阴离子结合，在细胞膜电动势的驱动下，插入到细胞膜上并形成多聚体，产生膜活性物质，在细胞膜结构中形成若干通道，破坏细胞膜完整性，使其内容物渗出，最终导致细菌崩解死亡[20]。支原体、螺旋体等致病微生物的胞膜带负电荷，也是防御素的攻击对象[21]。因此，与其他抗生素相比，防御素具有更广的抑菌谱，但防御素的抗菌活性容易受到血清或阳离子（如Na+、Ca2+）的抑制。防御素独特的抗菌机制可破坏结核分枝杆菌的细胞壁、细胞膜等生物学结构，从而抑制结核分枝杆菌[22-23]。如5 g/mL的人防御素-1（HNP-1）在适宜的pH值条件下可杀死胞内禽型分枝杆菌[24]。体外试验研究表明，哺乳动物α-防御素具有抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌的活性。Vera等[25]在研究人β-防御素-3（HBD-3）作用时发现，HBD-3通过与肽聚糖合成前体（lipid Ⅱ）结合抑制细胞壁肽聚糖的合成，导致细胞壁的局部损伤，引起菌体崩解，对金黄色葡萄球菌起到抑制作用。θ-防御素具有天然结构，主要通过与细菌结合中和细菌毒素发挥抗菌活性[26]。越来越多的研究表明，防御素通过多种途径起到抗菌作用[27]。防御素在治疗剂和疫苗成分方面的研究中也具有重要作用，研究领域主要是细胞培养模型中防御素的作用与体内病毒致病性之间的联系。2.2抗肿瘤及细胞毒效应哺乳动物防御素能溶解肿瘤细胞或诱导细胞凋亡。乳腺癌、肾癌、前列腺癌和皮肤癌等发病率持续上升。化疗药物广泛应用于癌症治疗，但具有非特异性毒性的严重缺点，这些化疗药物靶向任何快速分裂的细胞，无法区分健康细胞和恶性细胞。许多肿瘤最终均对常规化疗产生耐药性，现有化疗药物的局限性促进了对新的溶瘤疗法的研究。防御素是一个新的溶瘤剂家族，其可以避免常规化疗的缺点，对广谱的恶性细胞（包括多药耐药性肿瘤细胞）表现出选择性细胞毒性。防御素通常导致细胞膜溶解，也可以通过线粒体膜破裂引发癌细胞凋亡[28]。体外试验表明，人α-防御素-5通过靶向PI3K通路抑制结肠癌生长[29]；人β-防御素-1（HBD-1）通过细胞毒性作用对膀胱癌具有明显的体外抗肿瘤作用[30]。防御素对宿主细胞的一些细胞毒性限制了它们在医学中的积极应用。有研究表明，常规抗生素与防御素联合使用的抑菌效果更佳[31]。2.3调节免疫哺乳动物防御素参与体内免疫调节过程。免疫系统由先天免疫反应和适应性免疫反应组成。防御素不仅具有抑菌作用，还能够在感染或炎症的情况下激活适应性免疫系统[32]。α-防御素家族参与先天免疫系统，可对抗微生物感染[33]。研究表明，α-防御素可以作为趋化因子增强和改变适应性免疫反应，间接揭示了防御素的一种抗病毒机制[34]；α-防御素-1在体外促进M1到M2巨噬细胞的极化，通过M2巨噬细胞的极化间接对软骨细胞产生有益的影响，并在体内减轻骨关节炎（OA）的严重程度，表明它可能是OA的一种候选治疗方法[35]。防御素在牙周病的识别、预防和治疗方面具有极大潜力，防御素表达水平较低的人群更易患慢性牙周炎[36]。与健康口腔相比，患有口腔扁平苔藓（OLP）人群的口腔黏膜组织会表达更多的人β-防御素-2（HBD-2），表明HBD-2会给OLP的防治提供新思路[37]。2.4炎症反应和修复损伤组织哺乳动物防御素能够抑制嗜中性粒细胞趋化性和黏附，减弱促炎细胞因子和肺泡巨噬细胞的基因表达。Kaiser等[38]研究表明，在体外，通过细菌脂多糖以及炎症介质的刺激，可观察到防御素的诱导作用；在体内，防御素基因在感染和炎症状态下均出现上调，防御素基因调节通过转录因子（核因子NF-κB和IL-6）介导。防御素参与调节黏蛋白和紧密连接蛋白的表达。Peng等[39]研究表明，HBD-3具有抗菌和免疫调节功能，通过角质形成激活细胞自噬，缓解了IL-4和IL-13介导的紧密连接（TJ）屏障损伤，减轻了特应性皮炎（AD）中的皮肤炎症，并增强了TJ屏障[40]。李庆豪等[41]以仔猪空肠上皮细胞（IPEC-J2）为模型，发现猪β-防御素-2（pBD-2）通过调控细胞炎性因子的表达缓解黄曲霉毒素B1（AFB1）对小肠上皮细胞造成的炎症反应。θ-防御素的抗炎机制通过激活P13K/Akt通路和抑制免疫刺激细胞的促炎信号而介导[42]。3哺乳动物防御素的应用3.1哺乳动物防御素在动物饲料中的应用近年来，由于防御素具有抗菌能力且不产生残留而获得关注[43]。防御素在动物饲料中代替抗生素具有广阔的应用前景。严晓莉[44]以肉牛犊牛为研究对象，饲喂添加不同剂量猪防御素的基础饲料60 d后，与对照组相比，饲喂添加2 g/d猪防御素的肉牛犊牛血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素-10（IL-10）含量分别显著增加了0.25 g/L、1.31 g/L、66.59 ng/L，白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量分别显著降低了84.49、96.07 ng/L，表明防御素可以显著增强肉牛犊牛机体体液免疫功能和细胞免疫功能。朱锦兰等[45]以肉鸭为研究对象，饲喂添加450 g/t重组鸭β-防御素-2的基础饲粮39 d后，与对照组相比，饲喂添加重组鸭β-防御素-2的肉鸭平均日增重显著提高了4.09%，料重比显著降低了3.05%，表明重组鸭β-防御素-2制剂对肉鸭生长性能具有正面效果。Peng等[46]添加5 g/kg重组猪β-防御素-2（rpBD-2）在断奶仔猪基础饲料中，饲喂28 d后，与对照组相比，饲喂添加rpBD-2饲料的断奶仔猪平均日增重、平均日采食量分别显著提高了11.15%、10.78%，仔猪断奶后腹泻（PWD）的发病率显著降低了2%，表明rpBD-2可以作为抗生素饲料添加剂的替代物。3.2哺乳动物防御素在动物肠道稳态中的应用胃肠道是体内最大的免疫器官，在调节免疫稳态中具有重要作用。肠道上皮屏障是上皮细胞、免疫细胞和微生物之间的强烈交流形成对抗原的特异性免疫反应、平衡耐受性和效应免疫功能[47]。防御素参与并调控动物肠道的微生态平衡[48]。Tang等[49]合成了pBD-2，用于治疗肠毒素性大肠杆菌感染的断奶仔猪，患猪每日口服0.1 g/L的pBD-2两次，每次5 mL，连续用药21 d后，与口服无菌水的对照组相比，pBD-2可以提高患猪空肠绒毛高度和胰岛素样生长因子-I的表达增加，pBD-2具有抗菌功能，可以改善生长性能，减少炎性细胞因子的表达。严霞等[50]连续3 d肌肉注射重组鸭β-防御素-2（DAvBD2），剂量分别为200、250、300 μg/次，用于治疗感染多重耐药性大肠杆菌的雏鸡。结果显示，与对照组相比，注射DAvBD2的雏鸡存活率分别为30%、90%、100%，显著高于对照组；治愈率分别为20%、70%、80%，显著高于对照组，表明DAvBD2对感染多重耐药性大肠杆菌的雏鸡具有较好的治疗效果。常规抗菌药物在动物生产中使用时会产生药物残留。在反刍动物生产过程中若抗生素使用不当，不仅会破坏瘤胃内的微生物环境，还会产生药物残留及抗药性，给人类食品安全带来一定的隐患。防御素因其结构稳定，抗菌广泛，并且在肠道屏障功能、肠黏膜免疫反应以及微生物菌群平衡方面发挥积极作用，有望成为动物生产中抗生素的替代品[51]。人α-防御素-5抗菌肽衍生的肽模拟抗生素结合多个细菌靶标，在体外、体内对具有抗生素抗性的细菌高度有效，有望成为治疗由抗生素抗性细菌引起的感染的治疗剂[52]。但哺乳动物防御素的应用仍存在提取困难、提取费用高等问题，限制了防御素在动物生产中的应用。改良防御素提取工艺，以期获得性能稳定、生产成本低的防御素产品是值得深入研究的课题。3.3哺乳动物防御素对动物繁殖性能的影响哺乳动物防御素除具有广泛的抗微生物感染及免疫调节功能外，还参与哺乳动物的繁殖过程[53-54]。研究发现，防御素在哺乳动物雌性生殖系统中大量表达，并证实其具有促进卵母细胞和胚胎发育、成熟的作用，表明防御素与雌性哺乳动物生殖功能密切相关[55]。在细胞模型中，利用猪颗粒细胞研究猪β-防御素-2（pDEFB4B）和β-防御素-3（pDEFB103A）在卵巢卵泡发育期间的作用，猪颗粒细胞分别在1、10、50 mg/L的pDEFB4B或pDEFB103A中培养，发现卵泡发育过程中，pDEFB103A以浓度依赖的方式刺激颗粒细胞增殖，并能够显著增加细胞周期蛋白D1（CCND1）和增殖细胞核抗原（PCNA）的mRNA水平，刺激细胞增殖；pDEFB103A显著增加磷酸化-ERK1/2与非磷酸化的比率，表明pDEFB103A可能通过激活ERK1/2途径起作用[56]。产后子宫感染危及子宫健康、生育能力和奶牛的生产力，而子宫内膜先天免疫在消除子宫感染和保持子宫健康方面起到关键作用。使用qRT-PCR测定产犊当天子宫内膜组织中的舌抗菌肽（LAP）和钙结合蛋白（S100A8、S100A9、S100A12）含量，研究未发生产后子宫感染的健康奶牛和发生产后子宫感染的奶牛在围产期和产犊后前列腺素E和F代谢物（PGEM和PGFM）的浓度。结果显示，与产后子宫内膜炎和临床子宫内膜炎奶牛相比，健康奶牛中子宫内膜中IL-1β、TNF-α、BDEF-4、BDEF-5、S100A8、S100A12和PGFS的表达量较高，而IL-6、IL-8、IL-10、PGES和PGEM的表达较低。由此可知，在产犊前期，子宫内膜中IL-1β、TNF-α、PGFS、BDEF-4、BDEF-5、S100A8和S100A12基因的高表达和较低浓度的PGEM有益于奶牛的子宫健康[57]。Puig-Timonet等[58]在液体储存的公猪精液中添加浓度为1.5、3.0、5.0 mmol/L的猪β-防御素-1（pBD-1）和猪β-防御素-2（pBD-2），17 ℃下保存9~10 d，与对照组相比，3 mmol/L的pBD-1和pBD-2对细菌生长的抑制作用最强，表明pBD-1和pBD-2可作为液体储存的公猪精液中抗生素的合适替代品。4结论哺乳动物防御素具有抗多种感染性微生物（包括细菌、病毒、真菌）的活性，在微生物感染的免疫控制中作为免疫调节剂发挥重要作用。今后的研究需要将重点放在防御素如何有效且受控地递送和释放至感染部位、延长循环时间、增强蛋白水解稳定性和生物利用度、减轻防御素的潜在毒性等方面。防御素类药物在动物饲料添加剂、动物抗病育种、疾病防治等领域具有广泛的应用研究前景。