葡萄糖氧化酶（GOD）是一种耗氧脱氢酶，能够在有氧条件下将β-D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢（H2O2）。近年来，GOD作为新型饲料酶制剂备受关注，有关其催化机制与生理功能的研究也不断深入。GOD具有保护动物肠道完整、提高机体免疫力等功能，可作为一种新型、绿色的抗生素替代品在饲料生产中应用。目前，工业生产中使用的GOD主要由曲霉属和青霉属发酵而来，具有良好的生物活性，已被列入农业农村部《饲料添加剂品种目录（2013）》第4大类酶制剂。本文综合阐述了GOD的结构、催化机理以及其生物学功能，为后续GOD在畜牧行业中的应用提供参考。1GOD的研究进展GOD首先在黑曲霉提取物中发现[1]，之后在红藻、柑橘类水果、哺乳动物组织和细菌的提取物中也发现葡萄糖氧化酶活性[2]。随着GOD的基因序列和蛋白质结构的发布[3-4]，研究人员发现植物、哺乳动物组织和细菌中的葡萄糖氧化酶活性并不是由GOD引起。Bauer等[2]通过检索NCBI蛋白质数据库确定了50个物种（45种来自真菌，5种来自昆虫）存在GOD序列，其中没有出现哺乳动物、植物或细菌，表明GOD主要由真菌和昆虫产生。真菌各属产生的GOD的生物活性有差别。黑曲霉GOD催化活性比假单胞菌产生的GOD低，米氏常数较高[5-6]。因此，使用基因突变方法提高黑曲霉GOD抗氧化性[7]和热稳定性[8]尤为重要。在工业生产中，GOD的发酵形式包括固态发酵和浸没式发酵[9]。与固态发酵相比，浸没式发酵更容易控制发酵条件，GOD生产效率高，但固态发酵生产的GOD活性更好[10]。因此，研究人员采用基因重组技术、诱变和固定化酶技术寻求更高效的GOD生产方式[11]。2GOD的特性和结构GOD分子质量约130~175 kDa，为水溶性的淡黄色粉末，不溶于有机溶剂[12]。以黑曲霉GOD为例，是同型二聚体（糖蛋白）结构，中间由二硫键连接[13]。每个糖蛋白有2个区域，其中一个区域以β-折叠的形式与部分辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）密切结合；另一个区域以4个α-螺旋支撑1个反向平行的β-折叠形式与底物β-D-葡萄糖结合[12]。黑曲霉GOD蛋白活性位点为黄素环，其N5原子在催化葡萄糖反应中接受氢离子。N5原子周围只有His-516、His-559和Glu-412三个氨基酸，其形成晶体时，两个组氨酸残基的N原子发生质子化使GOD晶体活性位点的中心形成一个水分子，与His-516和His-559形成氢键，并与FAD相邻[14]。3GOD的催化机理Leskovac等[15]研究表明，GOD催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2，β-D-葡萄糖作为底物取代GOD活性中心的H2O，O2则作为电子受体。GOD的催化反应可以分为还原反应和氧化反应。还原反应中，GOD活性中心与葡萄糖结合后，His-516的碱性基团从葡萄糖的第一个羟基中吸引质子，氢离子此时从葡萄糖C1转移到GOD活性中心的黄素环N5上，此反应为还原反应的限速步骤[16]；氧化反应的限速步骤为电子从黄素环到O2的转移过程，可产生黄素半醌自由基和超氧阴离子[15,17]。在催化反应中，β-D-葡萄糖被氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯，之后在内酯酶存在的条件下，被水解生成D-葡萄糖酸，而FAD则被还原成FADH2。O2进入活性中心与FADH2发生接触，并将还原型辅基FADH2氧化为FAD，而氧分子被还原为H2O2[18]。4GOD在畜禽生产中的作用GOD作为抗生素替代品，可以避免长期使用抗生素造成的动物饲料利用率下降、机体免疫功能减弱、药物残留和耐药性问题，还能够提高动物生产性能、免疫力，提高饲料转化率[19-20]。4.1抑菌GOD具有广谱抗菌效果。Li等[21]研究发现，150 U/L的GOD可破坏灰芽孢杆菌的孢子细胞膜和细胞结构，抑制灰芽孢杆菌的孢子萌发和胚管伸长，当活性上升到2 400 U/L时可以杀死菌株。Brunner等[22]研究发现，GOD与葡萄糖混合可以抑制鸡蛋表面腐败菌群（肠炎沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌）的生长。Kriaa等[23]研究发现，30 AU的GOD能够显著杀死真菌，浓度达到125 AU时可抑制茄镰刀菌的生长和孢子的产生，减少衣原体孢子的形成，诱导菌丝体空泡化。Ji等[24]研究表明，在琼脂平板上涂富含GOD的生物膜可有效抑制粪肠杆菌和白色念珠菌的生长。4.2改善动物肠道健康4.2.1维持动物肠道微生物稳态肠道微生物群与宿主之间的相互作用有助于宿主免疫系统的成熟，提高宿主免疫力[25]。GOD可以提高肠道微生物多样性[26-28]，减少有害菌数量，提高有益菌数量[29-31]。有研究发现，与正常饲喂组相比，日粮中添加100 U/kg GOD，仔猪胃、回肠和粪便中沙门氏菌数量显著降低，乳酸菌数量增加40.00%，大肠杆菌数量下降14.67%[28,32]。研究表明，补充60、75、250、600 U/kg GOD的肉鸡盲肠中厚壁菌门（30%~54%）和拟杆菌门（3%~13%）的丰度显著增加，放线菌门的丰度显著降低[33-36]。Liu等[37]研究发现，在肉鸭日粮中添加200 U/kg GOD能够缓解大肠杆菌攻毒带来的负面影响，维持肠道菌群结构，促进肉鸭生长。4.2.2维持肠道完整性，改善肠道屏障动物肠道绒毛在营养吸收中起重要作用，并发挥物理屏障作用[38]。张庆丽等[39]研究发现，在基础日粮中添加1 000 U/kg GOD可显著提高肉鸡空肠绒毛高度以及空肠绒毛高度与隐窝深度（V/C）比值。Liu等[37]研究表明，在肉鸭日粮中添加200 U/kg GOD能够提高绒毛的高度，降低隐窝的深度，提高V/C。Sun等[29]研究表明，在基础日粮中添加60 U/kg GOD可以恢复敌草枯造成的母猪十二指肠V/C降低，表明GOD有可能减轻氧化应激引起的肠绒毛结构损伤，提高小肠消化和吸收营养的能力。肠道物理屏障是防止细菌、内毒素和其他有害物质穿过肠黏膜的重要防线[28,40]。紧密连接蛋白（CLDN、OCLN、ZO-1和MUC-2等）是肠黏膜屏障的重要组成部分[40]。Wang等[41]研究表明，在日粮中添加75 U/kg GOD可增加黄羽肉鸡空肠ZO-1、CLDN、OCLN和MUC-2基因表达。二胺氧化酶（DAO）主要位于小肠黏膜中[42-43]，血清DAO和乳酸水平升高反映了肠道通透性的变化，表明肠道屏障功能已受损[42,44]。Liu等[37]研究表明，在日粮中补充200 U/kg GOD能够有效降低肉鸭血浆DAO和乳酸水平，改善大肠杆菌感染造成的肠道物理屏障受损。4.2.3提高肠道蠕动能力，增加饲料利用率肠道蠕动不仅受神经元和肌源控制[45]，还受肠道中饮食成分、胆汁酸和肠道微生物的影响[46-49]。GOD催化生成的葡萄糖酸能够降低肠道pH值，促进肠道蠕动，从而提高饲料利用率[50]。葡萄糖酸不易被小肠吸收，通常进入后肠道进行发酵，间接刺激后肠道细胞生长，进一步促进营养物质吸收[51]。Biagi等[52]研究发现，葡萄糖酸增加了仔猪肠道中短链脂肪酸的含量，降低了空肠、回肠的pH值以及盲肠中的氨含量。吴昊等[53]研究发现，日粮中分别添加200 g/t 活性为2 493、2 519、5 508 U的GOD可以改善肉鸡采食量，提高平均日增重和阶段末重。研究表明，在日粮中添加500 U/kg GOD，母猪采食量在试验第28 d提高了6.26%[54-55]。因此，日粮中添加GOD能够促进肠道蠕动和营养物质的消化吸收，从而提高饲料利用率。4.3GOD增强抗氧化能力与免疫力GOD可与过氧化氢酶（CAT）组成氧化还原酶系统清除体内的活性氧（ROS），达到抗氧化的目的[56-58]。黄嘌呤氧化酶（XOD）和丙二醛（MDA）与脂质过氧化和禽类应激密切有关[59]。可作为氧化应激的指标[60]。Wang等[41]研究发现，在日粮中添加75 U/kg GOD，肉鸡肝脏抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著上升，而MDA水平和XOD活性显著降低，表明机体的总抗氧化能力（T-AOC）增强。Sun等[61]向仔猪日粮中联合添加50 U/kg GOD和1 U/kg CAT，结果发现，仔猪血浆和肠黏膜中超氧化物歧化酶（SOD）和CAT活性有所提高，MDA水平有所降低。因此，在敌草枯诱导的仔猪肠道氧化应激状态下，在日粮中联合添加GOD和CAT有助于缓解仔猪肠道的氧化损伤。添加GOD还可以抑制促炎信号通路的激活，减轻炎症对器官的不利影响。Wu等[62]研究发现，在肉鸡日粮中添加60 U/kg GOD可以使小肠中主要免疫因子二聚体IgA（sIgA）含量显著增加。Liu等[37]研究发现，在肉鸭日粮中添加200 U/kg GOD，可以增加鸭血浆中IgM含量，降低了促炎细胞因子、趋化因子、上游调节因子的浓度。穆淑琴等[63]研究发现，在仔猪日粮中添加100 U/kg GOD能够提升血清免疫球蛋白水平，从而增强仔猪对病原微生物的抵抗力。在保育猪基础饲粮中添加3 000 U/kg GOD可有效降低保育猪腹泻频率和死亡淘汰率[64]。4.4提高生产性能黄丹等[65]研究发现，在日粮中添加45 U/kg GOD，公猪血清中的雌二醇含量和精子活率显著升高，精子畸形率显著降低。在妊娠母猪日粮中添加200、500 U/kg GOD可提高妊娠母猪产仔数和泌乳性能[54,66-67]。研究发现，在鸡饲粮中添加2 U/kg不同种类的GOD，可提高肉鸡屠宰后24 h鸡胸肉红度和pH值，降低肉鸡的剪切力，增加肉鸡嫩度[41,62]。5GOD抑菌效果及对维持肠道健康的作用机制5.1GOD抑菌效果的作用机制GOD的抑菌效果主要是由于其产生的活性氧（ROS）。细胞ROS稳态在机体中具有重要生理功能[68]。高水平的ROS可能引起蛋白质、脂质和DNA氧化损伤，诱导细胞凋亡[69]，进而抑制真菌或细菌的生长和繁殖。Kriaa等[70]认为，GOD可能破坏细胞膜使细胞中蛋白质和糖分子流失，从而抑制真菌和细菌存活。5.2GOD维持肠道健康的作用机制GOD可催化葡萄糖产生葡萄糖酸，降低肠道pH值，提升肠道有益菌的丰度，并且有益菌发酵产生的短链脂肪酸可进一步降低肠道pH值，而真菌在低pH值环境中难以生长[71]。从GOD催化机理中可知，消耗氧气、产生葡萄糖酸和H2O2可能影响肠道菌群结构[52]，此过程会大量消耗肠道中的氧气，稳定肠道厌氧环境，促进厌氧益生菌的生长，抑制好氧有害菌的生长。葡萄糖酸经乳酸菌发酵后产生乳酸和乙酸酯，乙酸酯可被埃氏巨型球菌利用产生丁酸[72]，为结肠细胞供能，进而维持肠道屏障和肠道微生物群稳态[73]。但GOD维持肠道健康的具体机制仍不明晰，有待深入研究。6展望GOD具有维持肠道微生物稳态、提高畜禽免疫力等生物学功能。GOD可催化产生葡萄糖酸和ROS，改善肠道菌群丰度，增加有益菌群代谢物。ROS直接作为信号分子刺激细胞，使机体出现适应性反应，进而提高抗氧化和免疫基因的表达，但具体机制还有待研究。GOD目前在家禽、猪的生产中的研究较多，在牛、羊等反刍动物中的研究较少。这可能与反刍动物体型较大、GOD添加量较高、牛、羊试验成本较高等有关。反刍动物的能量来源以消化道微生物代谢产生的挥发性脂肪酸为主，而GOD能够提高有益菌丰度以及挥发性脂肪酸含量，因此GOD在反刍动物中具有较好的应用前景，可进一步探索。但目前GOD产量低、酶活性低、作用机制不明确，未来可以更多地关注提高GOD产量和酶活的方法以及GOD的作用机制，以期推动GOD在畜牧生产中的应用。