蛋白酶可将蛋白质分解为分子量较小的氨基酸或肽[1]，参与蛋白质消化、分解代谢和细胞信号传导等[2-3]，是重要的工业用酶，目前已广泛应用于饲料、食品、医药、皮革和化工等行业[4-6]。蛋白酶作为饲料添加剂能够提高饲料营养物质的消化率，改善畜禽的生长性能并减少肠炎的发生率[7-9]。日粮中添加一定量的蛋白酶能够显著提高羔羊、猪、鱼等畜禽的消化率和生长性能[10-12]。因此，蛋白酶在畜禽养殖行业应用越来越广泛[13]。广西、云南是我国主要的茧丝原料生产基地[14]，每年产生大量的缫丝废水[15-17]。缫丝废水无毒且富含丝胶蛋白和蚕蛹等高分子蛋白有机物，还含有大量氮、磷等无机盐物质，直接排放易造成水体富营养化，引起严重的环境污染[18-20]。利用废水培养微生物发酵产蛋白酶，微生物可以吸收分解高分子蛋白有机物，利用废水中的无机盐等营养物质进行生长。这种处理方式可以提高微生物生长性能，减少环境污染[21-24]。本试验利用缫丝废水发酵产蛋白酶的菌种并对产酶发酵工艺优化研究，以期为缫丝废水的再处理利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料和培养基缫丝废水由广西嘉联丝绸厂提供，预处理调pH值7.0，于4 ℃冷藏。斜面培养基：蛋白胨1.0 g、牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g、琼脂粉2.0 g、蒸馏水100 mL，pH值自然。筛选培养基：干酪素0.4 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、Na2HPO4·12H2O 0.11 g、KH2PO4 0.04 g、琼脂粉2.0 g、蒸馏水100 mL，pH值7.0。种子培养液：蛋白胨1.0 g、牛肉膏0.3 g、氯化钠0.5 g、缫丝废水100 mL，pH值7.0。发酵培养液：蔗糖1 g、氯化钠0.5 g、缫丝废水100 mL，pH值7.0。1.2蛋白酶活力测定利用福林酚法测酶活力[25]。1 mL粗酶液与1 mL底物（0.01 g/mL的酪素溶液）混匀，于40 ℃反应10 min，加入2 mL的0.4 mol/L三氯乙酸终止反应，静置10 min，10 000 r/min离心10 min。取1 mL离心后的上清液，依次加入5 mL的0.4 mol/L碳酸钠溶液、1 mL福林酚试剂，混匀，40 ℃保温显色20 min，于波长680 nm处测定吸光度。以先加入三氯乙酸终止反应的一组为对照组。酶活力定义：在40 ℃、pH值7.5条件下，每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位（U）。酶活计算公式为：X(U/mL)=A×K×N×4/10(1)式中：A为OD值；K为吸光常数，88.28；N表示酶液稀释倍数；4表示反应试剂总体积，4 mL；10表示反应时间，10 min。L-酪氨酸含量标准工作曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F001图1L-酪氨酸含量标准曲线1.3产蛋白酶菌株的筛选1.3.1初筛取5 g土壤样品溶于45 mL无菌水中，梯度稀释后分别取10-3~10-5土壤稀释液100 μL均匀涂布于筛选平板上，30 ℃恒温培养3~4 d，挑出单菌落纯化培养1~2 d。挑出纯化后的单菌落点接种于筛选平板，30 ℃培养3~4 d，观察菌落透明圈，选取透明圈直径（Dp）与菌落直径（Dc）比值（Dp/Dc）较大的菌株为初筛菌株。1.3.2复筛从斜面上刮两环活化初筛菌株接种于种子培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h，按10%接种量接种于发酵培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养3 d，取发酵液5 000 r/min离心10 min制备粗酶液，测定蛋白酶活力，挑选出酶活力最高的菌株为目标菌株。1.4菌种形态学鉴定和分子鉴定菌株接种于平板后定期观察菌落形态，革兰氏染色后用光学显微镜观察形态结构。另将菌种寄至广西南宁国拓生物有限公司测序，测序结果通过NCBI进行BLAST比对，下载同源性、相似度高的序列利用Mega软件构建系统进化树。1.5缫丝废水发酵产蛋白酶条件优化1.5.1产酶条件单因素试验在初始发酵条件即接种量10%、发酵温度30 ℃、摇床转速180 r/min振荡培养3 d的基础上，利用含缫丝废水发酵培养基，发酵培养基分别添加可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖以及乳糖作为发酵碳源，研究发酵培养基的最优碳源及碳源添加量。以最优碳源及添加量，分别研究发酵液初始pH值（6.0~8.5）、接种量（4%~16%）、摇床转速（120~200 r/min）、发酵温度（27~39 ℃）、发酵时间（48~96 h）对酶活力的影响。1.5.2正交试验优化发酵条件组合根据单因素试验结果，选取4个对产酶影响较大的因素设计正交试验，L16(45)正交试验因素水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.T001表1L16（45）正交试验因素水平水平A乳糖添加量/%B接种量/%C发酵液初始pH值D发酵温度/℃1177.03022107.53333138.03644168.5392结果与分析2.1菌种初筛结果从自然环境中筛选到7株产蛋白酶的菌株，初筛菌株产透明圈情况见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F002图2初筛菌株产透明圈情况由图2可知，菌株a、f能够在筛选培养基上生长，但没有出现透明圈，达不到筛选效果；菌株b出现透明圈但不明显；菌株c、d、e、g出现明显透明圈。各菌株Dp、Dc及Dp/Dc见表1。根据筛选原理，在酪素筛选培养基上蛋白酶产生菌能够将培养基中的干酪素分解成小分子氨基酸，Dp/Dc值越大酶活越高。因此，选择菌株c、d和e进行复筛。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.T002表2初筛菌株Dp/Dc值菌种编号Dp/cmDc/cmDp/Dca—0.11—b0.400.311.29c1.310.353.74d1.750.227.95e1.150.205.75f—0.05—g1.730.652.66注：“—”表示没有出现透明圈，无法计算Dp/Dc。2.2菌种复筛结果在特定的温度和pH值条件下，蛋白酶水解酪素底物，生成含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下可将福林酚试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法可测定其酶活力。因此，可通过检测蛋白酶水解酪素底物生成氨基酸的含量评价蛋白酶活性。复筛菌株酶活力测定结果见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F003图3复筛菌株酶活力测定结果由图3可知，菌株c、d和e发酵培养后收集粗酶液，测得酶活分别为1.51、3.21、2.32 U/mL。因此，选用菌株d进行下一步试验，将其标记为Z416。2.3菌种鉴定结果2.3.1菌株形态学鉴定结果（见图4）由图4可知，在平板培养基上培养2 d后形成的单个菌落较小，呈规则圆形，浅黄色，菌落表面湿润、圆滑，边缘整齐，不与培养基结合。结合形态结构特征初步判断菌株Z416为单细胞短杆状，革兰氏阳性菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F004图4菌株形态学鉴定结果2.3.2菌株分子生物学鉴定结果（见图5）由图5可知，菌株Z416的16S rDNA序列与硝基愈创木胶类节杆菌（Paenarthrobacter nitroguajacolicus strain L1）最相近（99%），因此鉴定其为硝基愈创木胶类节杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F005图5菌株Z416 16S rDNA序列建立的系统进化树2.4缫丝废水发酵产蛋白酶条件单因素试验结果2.4.1最优碳源及碳源添加量筛选结果（见图6、图7）由图6可知，以乳糖为碳源时，酶活力最高，为6.89 U/mL，其次分别为可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖；以蔗糖为碳源时，菌株Z416产酶活力最低。以乳糖、可溶性淀粉、葡萄糖为碳源时，蛋白酶活力相对较高，表明菌株Z416对这3种碳源的利用较好，反馈抑制较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F006图6碳源对酶活力的影响由图7可知，发酵液中乳糖最优添加量为3%，在此条件下菌株Z416酶活可达9.46 U/mL，后续单因素试验发酵液碳源统一为3%乳糖。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F007图7乳糖添加量对酶活力的影响2.4.2发酵液初始pH值对酶活力的影响（见图8）由图8可知，菌株Z416的适宜发酵pH值是在中性偏碱范围内。当发酵液初始pH值为7.5时酶活最高，为11.83 U/mL；pH值7.5时酶活逐渐下降；当初始pH值调至6时，所测酶活几乎为0，发酵液中菌株生长明显受到抑制，初步判断已不适宜菌株Z416的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F008图8发酵液初始pH值对酶活力的影响2.4.3接种量对酶活力的影响（见图9）由图9可知，接种量为13%时，菌株Z416的产酶活力最高，达11.56 U/mL。随着接种量的逐渐增大及逐渐减小，菌种Z416发酵产酶活力也逐渐降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F009图9接种量对酶活力的影响2.4.4发酵温度对酶活力的影响（见图10）由图10可知，在27~39 ℃发酵范围内，36 ℃产酶时酶活力最大，为10.47 U/mL；超过36 ℃时酶活急剧降低，说明该菌株不耐受高温，较适合常温培养。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F010图10发酵温度对酶活力的影响2.4.5摇床转速对酶活力的影响（见图11）由图11可知，摇床转速为180 r/min时，菌株Z416的产酶活力最高，为9.46 U/mL。在160~200 r/min转速范围内，酶活差别不大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F011图11摇床转速对酶活力的影响2.4.6发酵时间对酶活力的影响（见图12）由图12可知，发酵时间为84 h时产酶活力最大，为10.56 U/mL；超过84 h酶活力有较小幅度的降低，而较短的发酵时间不利于酶的合成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.F012图12发酵时间对酶活力的影响2.5正交试验及方法分析结果（见表3、表4）由表3可知，各因素对产蛋白酶活力影响的顺序为：乳糖添加量发酵液初始pH值接种量发酵温度；根据k值可知，菌种Z416发酵产蛋白酶最优组合为A4B4C2D2，即发酵液乳糖添加量4%、接种量16%、发酵培养基初始pH值7.5、发酵温度33 ℃。在最优条件下进行3次重复试验，在此条件下，菌株Z416酶活力达到17.89 U/mL，是优化前酶活力（3.21 U/mL）的5.57倍。由表4可知，发酵液乳糖添加量显著影响产酶水平，与极差分析一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.T003表3L16（45）正交试验结果项目ABCDE（空白）酶活力/(U/mL)1111115.172122227.983133338.164144446.355212349.036221438.517234129.5582432112.5093134210.41103243111.37113312410.11123421312.62134142311.98144131412.76154324115.23164413212.78k16.9159.1489.14310.02511.067k29.89810.15511.21510.64310.180k311.12710.76210.95710.33510.317k413.18811.0639.81310.1259.563R6.2731.9152.0720.6181.504主次因素ACBD最优组合A4B4C2D210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.18.014.T004表4正交试验方差分析项目平方和自由度均方F值P值误差4.5831.527A82.565327.52218.0080.05B8.57332.8581.8700.05C11.38333.7942.4830.05D0.89430.2980.1950.05注：P0.05表示影响显著；F临界值=9.280。3讨论本研究从自然环境中采样，采用福林酚法筛选出产蛋白酶的菌株Z416，通过形态学观察及分子生物学鉴定其为硝基愈创木胶类节杆菌（P. nitroguajacolicus）。采用单因素和正交设计试验得到最佳发酵组合为发酵液乳糖添加量4%、发酵培养基初始pH值7.5、接种量16%、发酵温度33℃。在此条件下，菌株Z416酶活力达到17.89 U/mL，是优化前酶活力的5.57倍。蛋白酶来源广泛，其中微生物发酵产酶是蛋白酶的主要来源。已有研究利用玉米粉[26]、棉粕[27]、豆粕[28]以及秸秆、麸皮等各种农副产品发酵生产蛋白酶[29]，在产蛋白酶菌株选育、提高发酵水平等方面取得一定的进展，但仍存在蛋白酶活低、发酵成本高等问题。蚕茧加工过程中，缫丝工序每生产1 t生丝将产生550~950 m3废水[30]。缫丝废水含有大量高分子蛋白有机物及氮、磷等无机盐物质，废水进入湖泊、水库、河口等缓流水体后，引起藻类等水生生物大量繁殖和水体溶解氧下降，导致水质恶化，严重破坏水产资源，使水体富营养化，引起严重的环境污染[18-20]。韦荣婷等[31]测定缫丝废水中总氮含量为1.504 g/L，其中蛋白质氮含量为1.144 g/L，总蛋白质含量为6.963 g/L，说明缫丝废水中含有丰富的蛋白质。此外，缫丝废水中还含有丰富的无机盐，可作为微生物发酵良好原料。本文利用缫丝废水作为发酵原料、硝化愈创木拟杆菌作为菌种，生产高酶活的蛋白酶。由于发酵原材料价格低廉易获取，该研究是企业废弃物循环再利用的有效途径，具有较好的经济效益和环保意义。4结论本试验筛选获得产蛋白酶的菌株Z416，通过形态学观察及分子生物学鉴定为硝基愈创木胶类节杆菌。优化发酵条件后，该菌株接入缫丝废水发酵培养基，产蛋白酶酶活力达到17.89 U/mL，表明缫丝废水是微生物发酵培养的良好原料。该蛋白酶具有应用到禽和猪饲料中的潜力，可以改善畜禽的生长性能。