蛋白质作为畜禽饲粮中的第二大营养组分，主要由豆粕提供。但养殖中豆粕的需求量大，会造成畜禽养殖成本的增加[1]。2021年，农业农村部提出了“豆粕减量”的营养调控技术目标，提出用其他蛋白类原料替代豆粕。菜籽饼是油菜籽榨油后的加工副产物，蛋白质含量为35%~45%，可作为蛋白质原料以及豆粕的替代品应用于家禽饲料中[2]。但菜籽饼的纤维、硫甙（Gls）等抗营养因子（ANF）含量较高，在家禽饲粮中应用受到限制[3]。高剂量的Gls会对家禽的甲状腺等脏器造成严重危害，随着育种技术的推进及加工工艺的改善，菜籽饼中Gls含量正逐渐下降。菜籽饼纤维由结构性多糖构成，结构性多糖含量约占菜籽饼的20%~40%，主要成分是果胶多糖、纤维素和半纤维素[4]。菜籽饼中的高水平纤维会抑制其他营养成分的吸收[4]，降低畜禽生产性能[5]。有研究表明，菜籽粕中的中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量与鸭子的表观回肠氨基酸消化率呈显著负相关[6]。微生物固态发酵是降低饲料ANF、提高营养物质利用的有效途径之一[7-9]。Wang等[10]研究表明，发酵可显著降低菜籽粕Gls含量，同时使NDF降低了13.21%。但Olukomaiya等[11]研究发现，发酵后菜籽粕NDF及ADF等纤维含量升高，饲喂发酵菜籽粕降低了肉鸡的生产性能及回肠粗蛋白消化率[12]。目前，对发酵菜籽饼的研究主要集中在降低其Gls含量的方面，关于微生物发酵对菜籽饼纤维的降解作用研究较少。本试验以菜籽饼为研究对象，运用优化发酵工艺，探讨微生物固态发酵对菜籽饼纤维的降解效果及对养分的改善作用，为菜籽饼在家禽中的有效利用提供参考。1材料与方法试验于2021年12月至2022年5月在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室进行。1.1试验材料与试剂枯草芽孢杆菌（B. subtilis 10090）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；植物乳杆菌（L. plantarum）由动物营养学国家重点实验室保存。主要原料：菜籽饼（rapeseed cake，RSC）购自天津，粉碎过0.42 mm筛。培养基：MRS培养基、LB培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。1.2试验方法1.2.1菌种发酵液制备将枯草芽孢杆菌及植物乳杆菌分别在LB培养基及MRS培养基划线培养后，挑取单菌落，分别接种于LB、MRS液体培养基中，37 ℃、200 r/min条件下培养24 h，按1%的接种量分别接种到含有100 mL液体培养基三角瓶中，培养18 h。草芽孢杆菌菌落数2.80×108 CFU/mL、植物乳杆菌菌落数2.91×109 CFU/mL。1.2.2发酵过程准确称取50.0 g菜籽饼置于500 mL三角瓶中，将菌株发酵液按照一定比例的接种量接种至菜籽饼培养基中，加入蒸馏水调整液料比，搅拌均匀，用无菌透气过滤封口膜封口，在37 ℃条件下恒温静置发酵72 h。发酵结束后于55 ℃低温烘干，粉碎过0.42 mm筛。1.3发酵工艺优化1.3.1最佳混菌比例的探讨以发酵后菜籽饼的NDF降解率（%）、Gls降解率（%）、酸溶蛋白（TCA-SP）增加率（%）为评价指标，以总变化率（Y）为综合评价指标，探讨枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌发酵菜籽饼的最佳混菌比例。采用2×3的两因素完全随机区组设计，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌各设置3个不同接种水平，共9个处理，重复3次。混菌比例试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T001表1混菌比例试验因素水平设计水平枯草芽孢杆菌植物乳杆菌18221043126%准确称取50.0 g菜籽饼于500 mL三角瓶中，将不同混合比例菌液接种到菜籽饼上，添加蒸馏水调整液料比为1∶1，搅拌均匀后用无菌透气过滤封口膜封口，置于37 ℃条件下发酵72 h。Y=0.7×NDF降解率+0.15×Gls降解率+0.15×TCA-SP增加率(1)1.3.2发酵工艺优化在确定两种菌的最佳混合配比后，以总变化率（Y）为综合评价指标，以接种量、液料比、发酵温度及发酵时间为试验因素，采用四因素三水平的正交随机区组设计，每个试验重复3次。L9(34)正交试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T002表2L9 （34）正交试验因素水平设计水平A接种量/%B液料比/(mL/g)C发酵温度/℃D发酵时间/h180.833722101.035963121.2371201.4发酵菜籽饼Gls和营养物质含量测定参照文献[13]采用氯化钯比色法测定Gls含量；105 ℃烘箱干燥4 h测定干物质（DM）；参照NY/T 3801—2020测定TCA-SP含量[14]；参照GB/T 20806—2006采用Van Soest分析法测定NDF含量[15]。1.5数据统计与分析试验数据采用Microsoft Excel软件进行初步处理，SAS 9.4软件的GLM板块对混菌比例发酵菜籽饼结果进行两因素方差分析。对发酵工艺优化部分的总变化率结果进行正交设计方差分析，进行主体间效应值检验；对NDF降解率、Gls降解率及TCA-SP增加率结果进行单因素方差分析。采用Duncan's法对各处理的平均值进行多重比较，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同混菌比例发酵菜籽饼的效果（见表3）由表3可知，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的交互作用对发酵菜籽饼NDF降解率及总变化率具有显著影响（P0.05）。当枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例为5∶1时，总变化率最高，为20.56%，且对菜籽饼的NDF降解效果最佳。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T003表3不同混菌比例发酵菜籽饼的结果（干物质基础）项目NDF降解率Gls降解率TCA-SP增加率总变化率枯草芽孢杆菌/%植物乳杆菌/%82-4.75d64.4459.5715.28e4-7.84e66.0556.6812.92f6-1.76c65.2963.4518.08cd1022.74a62.2162.0720.56a4-4.52d63.8268.4016.67de6-0.26bc66.2769.2920.15ab1220.28b63.8663.2419.26abc4-1.88c66.4365.6318.49bc6-0.50bc69.1665.9819.92abSEM0.581.812.650.53枯草芽孢杆菌/%8-4.7865.2659.90b15.4310-0.6864.1066.59a19.1312-0.7066.4864.94a19.22植物乳杆菌/%2-0.5863.5061.6318.374-4.7565.4463.5716.036-0.8466.9166.2419.39P值枯草芽孢杆菌0.010.300.020.01植物乳杆菌0.010.100.130.01枯草芽孢杆菌×植物乳杆菌0.010.750.470.01注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。%2.2正交试验及方差分析结果（见表4、表5）由表4可知，温度对总变化率的影响最大，发酵时间次之，发酵的液料比及接种量的影响最小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T004表4正交试验极差分析结果项目ABCDNDF降解率/%Gls降解率/%TCA-SP增加率/%总变化率（Y）/%11111-4.9451.1538.059.92212220.4340.3774.8817.5931333-2.2845.7875.1316.54421230.3838.8676.5417.5852231-3.8144.1347.9111.1462312-2.8143.2166.1314.43731320.6956.8654.7817.2383213-1.4344.2860.2214.67933212.3043.8572.4219.05k114.6914.9113.0113.37k214.3814.4718.0716.42k316.9816.6714.9716.27R2.602.215.062.90优水平A3B3C2D2排序CDAB由表5可知，接种量、液料比、温度及发酵时间对总变化率均具有显著影响（P0.05）。结合k值分析可知，混菌固态发酵菜籽饼的最佳工艺为接种量12%、液料比1.2 mL/g、发酵温度35 ℃、发酵时间96 h，此时总变化率在理论上最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T005表5正交试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值校正模型233.141023.3134.660.01区组0.6420.321.420.27A12.1426.0727.010.01B8.1724.0918.200.01C39.11219.5687.210.01D17.7028.8539.440.01误差10.7616总计321.0226校正的总计243.9026注：P0.05表示影响显著。2.2.1不同发酵条件和水平固态发酵对菜籽饼NDF降解率的影响（见表6）由表6可知，接种量为12%时，发酵菜籽饼的NDF降解率显著高于8%和10%（P0.05）；温度为35 ℃时，发酵菜籽饼的NDF降解率显著高于其他水平（P0.05）；液料比和发酵时间对NDF降解率无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T006表6不同发酵条件及水平固态发酵对菜籽饼NDF降解率的影响（干物质基础）项目ABCD1-2.26b-1.29-3.06b-2.152-2.08b-1.601.04a-0.5630.52a-0.93-1.80b-1.11SEM0.690.820.550.79P值0.010.840.010.37%2.2.2不同发酵条件和水平固态发酵对菜籽饼Gls降解率（见表7）由表7可知，发酵温度为37 ℃时，发酵菜籽饼的Gls降解率最高，显著高于35 ℃（P0.05）。其他因素对Gls降解率无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T007表7不同发酵条件及水平固态发酵对菜籽饼Gls降解率的影响（干物质基础）项目ABCD145.7648.9646.21ab46.37242.0742.9241.02b46.81348.3344.2848.92a42.97SEM2.082.081.952.19P值0.120.120.030.41%2.2.3不同发酵条件和水平固态发酵对菜籽饼TCA-SP增加率的影响（见表8）由表8可知，发酵温度为35 ℃时，发酵菜籽饼的TCA-SP增加率显著高于其他水平（P0.05）；发酵时间为96、120 h时，发酵菜籽饼的TCA-SP增加率显著高于72 h（P0.05）；液料比为0.8 mL/g时，发酵菜籽饼的TCA-SP增加率最低，显著低于其他两个水平（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T008表8不同发酵条件及水平固态发酵对菜籽饼TCA-SP增加率的影响（干物质基础）项目ABCD162.6856.46b54.80b52.79b263.5361.00a74.61a65.26a362.4771.23a59.27b70.63aSEM4.664.123.573.85P值0.990.050.010.01%2.3正交试验验证试验结果参照最佳混菌比例，接种量12%、液料比1.2 mL/g、35 ℃条件下混菌发酵菜籽饼96 h，以此条件进行验证试验，结果见表9。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.17.011.T009表9验证试验结果（干物质基础）项目NDF降解率Gls降解率TCA-SP增加率总变化率结果3.0957.53120.7728.91%由表9可知，混菌固态发酵菜籽粕的NDF降解率为3.09%，Gls降解率为57.53%，TCA-SP增加率为120.77%，总变化率为28.91%。3讨论3.1枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌不同混合比例对菜籽饼发酵效果的影响本试验所选用的枯草芽孢杆菌及植物乳杆菌均属于饲料中允许使用的微生物添加菌种。枯草芽孢杆菌在发酵过程中能够分泌多种酶类，如纤维素酶、半纤维素酶和植酸酶等[16]，可对抗营养物质起到一定的降解作用；植物乳杆菌在发酵过程中可产生乳酸等代谢产物，提高总酸度，改善饲料的风味[9]。研究表明，混菌发酵的效果优于单菌发酵[17]。因此，本试验选用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌进行配伍发酵。本研究发现，枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌的交互作用对发酵后菜籽饼的NDF降解率及总变化率的影响显著。在枯草芽孢杆菌接种量相同的条件下，随着植物乳杆菌接种量上升，菜籽饼NDF降解率和总变化率总体上呈现“V”字形变化。这可能是由于植物乳杆菌在发酵过程中产生有机酸，且随着植物乳杆菌接种量上升，产酸量增加，造成体系中pH值降低，在一定程度上抑制了枯草芽孢杆菌的生长，进而对NDF降解率和总变化率产生影响。Wang等[10]研究表明，利用乳酸菌、地衣芽孢杆菌及酵母菌对菜籽粕进行混菌发酵，菜籽粕NDF降低了14.64%。然而本试验中，只有个别处理后，菜籽饼的NDF得到降解，大部分处理出现NDF升高的现象，与Olukomaiya等[11]的研究结果相似。Olukomaiya等[11]研究发现，使用大豆曲霉和酱油曲霉对菜籽粕进行发酵后，菜籽粕的NDF、ADF及半纤维素等含量变高。微生物在发酵菜籽饼等饲料时，往往会优先利用单糖、寡糖及淀粉等易利用的养分，最后再利用难以分解利用的碳源。因此，低聚糖等碳水化合物被微生物利用及Gls被降解产生的“浓缩效应”，可能是NDF水平增加的原因[18]。本试验综合考察指标中，NDF降解率占总变化率的70%，因此总变化率与NDF降解率出现相同变化趋势。本试验发现，枯草芽孢杆菌不同接种量对TCA-SP增加率具有显著影响。当接种量为10%时，TCA-SP增加率最高。TCA-SP主要是由氨基酸残基组成的寡肽，更易被动物消化吸收。动物吸收寡肽的能力高于游离的氨基酸[19]。Tie等[20]研究发现，黑曲霉对菜籽粕发酵后，菜籽粕的TCA-SP含量显著上升，体外蛋白消化率也有所提高。枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌在发酵体系中协同共生，发酵初期，枯草芽孢杆菌能够快速分解利用体系中的大分子蛋白和碳水化合物，降低体系中的氧气浓度，降低体系的pH值，更利于植物乳杆菌的生长和发酵饲料的保存[18]。Xu等[21]研究表明，枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌发酵后显著降低了菜籽粕的Gls等ANF。Wang等[22]研究表明，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母发酵显著提高了菜籽粕的小肽含量，降低了Gls含量。3.2不同发酵条件对菜籽饼发酵效果的影响影响菜籽饼发酵效果的因素包括温度、接种量、发酵时间、液料比的预处理等[23-24]。其中温度是影响发酵效果的重要因素，微生物在不同温度条件下的生长代谢差异较大，枯草芽孢杆菌的适宜发酵温度在28~37 ℃之间[17,25]，植物乳杆菌的适宜发酵温度一般为37 ℃[26]。吴正可等[27]研究发现，当液料比为1∶1、发酵接种量为15%、温度为33 ℃、发酵时间为84 h时，菜籽粕的发酵效果最佳。张江波[28]研究表明，混菌发酵醋糟的最佳工艺为接种量12%、初始水分50%、温度35 ℃、发酵时间72 h。黄威等[29]研究表明，发酵菜籽粕制备多肽的最佳液料比为1.189。水分含量过高不利于发酵体系中的气体流动交换，一般以适宜的含水量进行发酵处理[17]。由于本研究所用的枯草芽孢杆菌为好氧菌，且菜籽饼纤维结构复杂，发酵时间过短不利于微生物对纤维的降解，过长会导致体系中养分被过度消耗进而降低菜籽饼总体营养价值。因此，本试验以接种量、液料比、温度及发酵时间为试验因素进行了混菌固态发酵菜籽饼工艺优化的研究。本试验结果表明，在35 ℃发酵条件下，菜籽饼发酵后的NDF降解率、Gls降解率及TCA-SP增加率显著提高。温度直接影响微生物代谢所分泌的酶活性[30]，进而影响底物的发酵效果。本试验在35 ℃时的NDF降解率、TCA-SP增加率及总变化率最高，说明35 ℃是此混菌发酵体系中的最适温度。发酵时间也是影响发酵效果的重要因素之一。本研究结果表明，发酵时间对总变化率具有显著影响。随着发酵时间延长，总变化率显著升高，这与吴正可等[27]的研究结果相似。NDF和Gls降解率出现相同趋势，在发酵96 h时最高。延长发酵时间可以提高发酵的效果，但发酵时间过长，微生物过度消耗体系中的养分，进而降低了发酵菜籽饼的总体养分含量。水分是微生物生长代谢的必要成分，水分过高或过低均不利于微生物生长代谢。此外，液料比对TCA-SP增加率具有显著影响。随着接种量增加，NDF降解率显著提高。这可能是由于微生物数量增多，快速消耗易分解的碳源，随后开始分解菜籽饼中的结构性多糖[10]。本试验在最优条件下利用混菌发酵菜籽饼，菜籽饼TCA-SP增加率为120.77%。混菌发酵组的Gls含量显著降低，其降解率为57.53%，表明所用菌株对Gls有较强的降解能力。朱晓峰等[2]研究发现，用乳酸杆菌发酵菜籽粕，Gls含量降低了43.43%。郝怡宁等[31]研究发现，使用枯草芽孢杆菌和雅致放射毛霉混菌发酵菜籽粕，Gls含量降低了45.26%。本试验所用菌株降解Gls能力高于上述文献菌株。本试验结果表明，混菌发酵菜籽饼，NDF的降解率为3.09%，降解效果不明显，可能是由于菜籽饼细胞壁结构错综复杂，纤维互相缠绕形成坚固的网状结构[4]。研究表明，枯草芽孢杆菌在发酵过程中可分泌纤维素酶、半纤维素酶及果胶酶等[16]。本试验所用的枯草芽孢杆菌具有分泌果胶酶的功效，但对纤维的降解效果较差，可能是由于分泌的酶量不足以将细胞壁纤维网状结构分解，说明枯草芽孢杆菌降解纤维的作用有限，这与王卫卫[18]研究结果相近。4结论本试验确定了混菌固态发酵菜籽饼的最佳条件，其中混菌比例为枯草芽孢杆菌∶植物乳杆菌=5∶1，最佳发酵工艺为接种量12%、液料比1.2 mL/g、温度35 ℃、发酵时间96 h，此时Gls降解率为57.53%，TCA-SP增加率为120.77%，NDF降解率为3.09%，总变化率为28.91%。混菌固态发酵有效降低了菜籽饼Gls含量，增加了TCA-SP含量，改善了菜籽饼的营养价值。