鳗鲡（Anguilla）是我国重要养殖经济鱼类之一。《2019中国渔业统计年鉴》统计数据显示，2018年全国鳗鲡产量为23.3万t，连续多年在出口创汇的单一水产品中排名第一[1-2]。白仔鳗阶段是鳗鲡养殖成功的关键时期。传统的白仔鳗培育主要以红虫（学名颤蚓）为开口饵料。但是，红虫价格昂贵，培养过程易污染环境，投喂过程容易携带病原[3-4]。近年来，人工开口配合饲料在鳗苗培育过程中的应用越来越多。开口配合饲料加工过程安全卫生、营养均衡[5-6]。在仔鱼阶段，肠道发育未成熟，功能也未完善，开口饵料的营养水平可影响鱼类肠道的菌群组成和健康状况[7-8]。因此，试验研究美洲鳗鲡（Anguilla rostrata）白仔苗，比较投喂两种开口饵料后，白仔鳗肠道菌群的差异情况，为鳗鲡白仔苗的科学培育提供参考。1材料与方法1.1试验动物与试验饲料试验所用美洲鳗鲡白仔苗来自福建省三明市清流县清泉特种水产养殖场。白仔苗采用半流水模式培育，平均规格为700尾/kg，在该养殖场鳗苗培育过程中不同养殖池分别投喂红虫和开口配合饲料，养殖30 d后在不同养殖池随机采集投喂不同开口饵料白仔鳗肠道样品，分别为Tubifex组和Starter组。在白仔鳗养殖期间，水温25~29 ℃，pH值6.5~7.0，溶解氧浓度5.0~12.0 mg/L，亚硝酸盐浓度0.11~0.19 mg/L。红虫由养殖场购买，开口配合饲料由福建天马科技集团股份有限公司生产（商品名“益多美”），主要营养水平：水分78%、粗蛋白质15%、粗脂肪2%、粗灰分3%、钙0.5%、总磷0.5%。1.2样品采集将2组中活力好、健康无病的美洲鳗鲡白仔苗禁食24 h后，随机取8尾利用丁香酚（100 mg/L）麻醉，75%乙醇擦拭体表，然后利用无菌剪刀和镊子，从腹腔中轻轻分离出肠道，经PBS缓冲液冲洗，置于无菌1.5 mL离心管中。试验采用混样操作，即每2尾美洲鳗鲡白仔苗肠道混合为1个肠道样品。分别标记为Tubifex组（样品编号A1~A4）和Starter组（样品编号A5~A8），保存于-80 ℃条件下待分析。1.3DNA的提取和肠道菌群生物信息分析所有样品肠道DNA按照PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio Laboratories，Carlsbad, CA）试剂盒说明书进行提取，再使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和质量，采用NanoDrop Lite（Thermo Scientific，USA）分光光度计确定浓度。合格的样品使用16S rDNA通用引物338F（5'-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GACTACHVGGGT WTCTAAT-3'）进行PCR扩增，PCR产物使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，Germany）试剂盒进行提取，委托北京奥维森基因科技有限公司利用Illumina MiSeq（Illumina，San Diego，CA，USA）平台进行16S rDNA高通量测序，并将得到的数据进行生物信息学分析，具体操作步骤参照Shi等[9]的方法进行。1.4数据统计与分析利用QIIME version v.1.8平台计算Shannon指数和Chao1指数，以确定菌群的alpha多样性，使用R语言进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），使用Python v2.7软件进行LEfSe分析（设置LDA Score的筛选值为3.5，P0.05），分析组间相对丰度具有统计学意义的差异菌。2结果与分析2.1不同美洲鳗鲡白仔苗肠道样品的稀释曲线（见图1）由图1可知，横坐标为采集到样本序列的个数，纵坐标为观测到OTUs的个数。每条曲线代表一个样本，使用不同的颜色标记。OTUs的数量随着测序深度的增加而增加。当所有样本的稀释曲线趋于平稳时，检测到的OTUs数量不会随着提取数据的扩大而增加，说明此时测序数据量充足合理，大多数菌群已被检出，更多的数据量对发现新的OTUs的边际贡献很小，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTUs。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F001图1不同美洲鳗鲡白仔苗肠道样品的稀释曲线2.2投喂不同开口饵料对美洲鳗鲡白仔苗的肠道菌群alpha多样性的影响（见图2）由图2可知，Starter组比Tubifex组有更高的Chao1指数和Shannon指数。图2投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群alpha多样性10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F002(a)Chao1指数比较10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F003(b)Shannon指数比较2.3投喂不同开口饵料对美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群beta多样性的影响（见图3）由图3可知，通过PLS-DA分析Tubifex组和Starter组的相似性，PC1=30.44%，PC2=17.42%，Tubifex组和Starter组之间没有交集，且同一个组的样本聚类比较紧密，说明Tubifex组和Starter组间的样本分离良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F004图3投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群beta多样性2.4投喂不同开口饵料对美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群在门水平上的组成的影响（见图4）由图4可知，Tubifex组和Starter组美洲鳗鲡白仔苗在门水平上肠道菌群种类大致相同，以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝菌门（Cyanobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）等为优势菌门；其中厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）这2个门所占比例在93%以上，但拟杆菌门相对丰度存在一定差异。图4投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群在门水平上的组成比较10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F005（a）Tubifex组肠道菌群在门水平上的组成10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F006（b）Starter组肠道菌群在门水平上的组成2.5投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群的LEfSe分析（见图5）由图5可知，使用LEfSe分析鉴别的不同组美洲鳗鲡白仔苗肠道中共有13个属细菌存在显著差异（P0.05）。Tubifex组乳球菌属（Lactococcus）、Reyranella、浮丝藻菌属（Planktothrix）、土孢杆菌属（Terrisporobacter）和Ruegeria的相对丰度显著增加（P0.05）。Starter组芽孢杆菌属（Bacillus）、厌氧芽孢杆菌属（Anaerobacillus）、不动杆菌属（Acinetobacter）、分节丝状菌属（Candidatus arthromitus）、贪噬菌属（Variovorax）、布劳特氏菌属（Blautia）、志贺氏埃希菌属（Escherichia shigella）和邻单胞菌属（Plesiomonas）的相对丰度显著增加（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.05.013.F007图5投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群的LEfSe分析3讨论在微生物学研究中，Chao1指数反映物种的丰富程度，Shannon指数反映物种的多样性[10]，而beta多样性分析是考察不同样本之间群落结构的相似性[11]。研究发现，Starter组美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群的Chao1指数和Shannon指数高于Tubifex组，表明该组白仔鳗肠道菌群的物种丰富度和多样性高。肠道菌群beta多样性的结果也说明Starter组和Tubifex组肠道菌群存在一定差异。本试验中，美洲鳗鲡白仔苗肠道菌群主要以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门等为优势菌门，其中厚壁菌门和变形菌门所占比例较高，与其他多种鱼类肠道菌群门水平上的结果一致[12-15]。与Tubifex组相比，Starter组的拟杆菌门相对丰度较高。拟杆菌门在鱼类肠道菌群中比较常见，能够利用多糖释放抗炎物质，维持免疫系统的平衡，参与类固醇、多糖和胆汁酸的代谢，帮助宿主吸收多糖和合成蛋白质[16-17]，有助于美洲鳗鲡白仔苗的肠道健康。在属水平上，Tubifex组美洲鳗鲡肠道中乳球菌属、Reyranella、浮丝藻菌属、土孢杆菌属和Ruegeria相对丰度显著增加。研究表明，乳酸菌属于乳球菌属，是一种常见的益生菌，可以提高鱼类的生长速度、先天免疫能力以及被致病菌感染宿主的存活率[18]；但乳球菌属中的格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）是目前水产养殖中引起乳球菌病的重要致病菌[19]，可导致虹鳟（Oncorhynchus mykiss）肠炎暴发[20-21]。试验未对细菌进行种水平鉴定，不能确定肠道内是否存在格氏乳球菌，这一点还有待于进一步证明。Reyranella是一种革兰氏阴性菌，可改善斑马鱼的免疫功能，但很少出现在养殖的鱼类肠道中[22]，其在系统发育上与红螺藻科非常接近，可用作单细胞真核浮游植物的益生菌[23-24]。浮丝藻菌被认为是蓝细菌中最可能产生毒素的菌。Ruegeria是水环境中最为常见的细菌之一[25-26]。以上3种菌尚未见在其他鱼类肠道中的有关报道，其在鳗鲡肠道中的功能还有待进一步研究。与Tubifex组相比，Starter组美洲鳗鲡白仔苗肠道中芽孢杆菌属、厌氧芽孢杆菌属、不动杆菌属、分节丝状菌属、邻单胞菌属、布劳特氏菌属、志贺氏埃希菌属和贪噬菌属相对丰度显著增加。其中，芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，是厚壁菌门的一员，广泛应用于水产养殖。作为典型的益生菌，多种芽孢杆菌可增强宿主免疫力[27]，能提高消化酶的活性以及对致病性弧菌的抵抗能力[28]。厌氧芽孢杆菌也属于厚壁菌门，可参与能量吸收，在鱼体内具有益生菌的特性[29]。不动杆菌是一种革兰氏阴性菌，已在鱼肠道中被分离得到[30]。在澳洲鳗鲡（Anguilla australis）、花鳗鲡（Anguilla marmorata）和日本鳗鲡（Anguilla japonica）肠道中确定为优势菌属，并且占有很高比例，也是银鲫（Carassius auratusgibelio）、青鱼（Mylopharyngodon piceus）、鳙（Parabramis pekinensis）等淡水鱼中的优势菌属，可以有效预防病原菌感染，产生消化酶和抑制鳗弧菌的物质[31-33]。分节丝状菌是革兰氏阳性、孢子形成的分节丝状菌的统称，因其能够调节宿主免疫反应和肠上皮细胞功能而备受关注[34-35]。研究表明，邻单胞菌是罗非鱼（Oreochroms mossambcus）肠道中的优势属之一，可作为益生菌的重要候选菌[36-37]。布劳特氏菌能够显著提升肠道短链脂肪酸的数量、清除肠道内气体[38]。志贺氏埃希菌是水产动物常见条件性致病菌，在特定条件下，会导致水产动物肠道疾病的发生[39]。目前，贪噬菌属在鱼类肠道中未见报道，其在鳗鲡肠道中的功能还有待于进一步研究。可见，投喂开口配合饲料可增加美洲鳗鲡白仔苗肠道中潜在益生菌种类和相对丰度。4结论投喂不同开口饵料美洲鳗鲡白仔苗的肠道菌群存在明显差异，使用开口配合饲料可增加肠道菌群多样性及潜在的益生菌。